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第一节 抗原的提取及纯化1

一、抗原1

二、抗原的制备及纯化1

第一章 抗体的制备1

三、抗原纯度的鉴定方法3

第二节 特异性抗血清的制备8

一、生产抗血清的免疫程序8

二、IgG单价免疫血清制备方法9

三、抗血清效价及纯度鉴定10

第三节 免疫球蛋白的制备14

一、免疫球蛋白的概念14

二、免疫球蛋白的制备15

一、凝胶过滤法17

第四节 蛋白质的纯化技术17

二、离子层析法20

三、免疫吸附剂25

第二章 单克隆抗体的制备技术及应用29

第一节 单克隆抗体制备技术29

一、免疫动物29

二、骨髓瘤细胞的培养31

三、饲养细胞32

四、细胞融合32

五、杂交瘤细胞的选择性培养33

六、杂交瘤细胞培养液中特异性抗体的检测34

七、杂交瘤细胞的克隆化35

八、单克隆抗体的制备36

十、培养液和有关溶液的配制37

九、杂交瘤的冷冻保存及复苏37

第二节 单克隆抗体的纯化及鉴定38

一、单克隆抗体的纯化38

二、单克隆抗体的鉴定39

第三节 单克隆抗体的应用39

一、特异性抗原的发现及提纯39

二、临床生化诊断中的应用40

三、病理组织定位诊断中的应用40

四、体内肿瘤的定位40

五、用单克隆抗体治疗肿瘤41

六、单克隆抗体在肿瘤研究中存在的问题41

一、组织标本的取材及保存44

第三章 免疫组织化学的基本技术44

第一节 细胞组织材料的准备44

二、细胞标本的取材及保存46

第二节 组织细胞材料的固定47

一、固定液48

二、固定方法的选择及注意事项51

第三节 组织脱水、浸蜡及包埋53

一、石蜡包埋法53

二、碳蜡包埋法53

三、冷冻干燥包埋法54

四、塑料包埋法54

第四节 组织切片55

一、切片前的准备工作55

二、石蜡切片56

三、冰冻切片57

四、碳蜡切片58

五、细胞涂片及印片58

第五节 免疫组化染色过程中的一些基本技术58

一、实验设计58

二、酶消化59

三、抗体的稀释度60

四、抗体稀释度的测定方法61

五、抗体的配制63

第四章 免疫荧光组织化学技术65

第一节 荧光抗体的制备65

一、荧光和荧光素65

二、异硫氰酸荧光素标记方法67

三、荧光抗体的鉴定70

四、四乙基罗达明B200标记方法70

五、四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)标记方法72

第二节 荧光抗体染色方法72

一、直接法72

二、间接法73

三、补体法74

四、膜免疫荧光染色方法75

五、荧光抗原法75

六、半抗原夹心法75

七、双重免疫荧光染色方法75

第三节 荧光显微镜76

一、荧光显微镜的原理76

八、染色标本的保存及封片介质的制备76

二、荧光显微镜的应用77

三、荧光显微镜的结构和部件77

四、透射荧光显微镜78

五、反射荧光显微镜79

六、激励方法80

七、反射荧光与透射荧光的优缺点80

八、透射荧光显微镜和反射荧光显微镜的比较81

九、使用荧光显微镜时应注意的事项82

第四节 荧光显微镜摄影方法82

一、摄影步骤82

二、常见问题及解决方法83

一、藻红蛋白的特征85

第五节 一种新型的免疫荧光标记物—藻红蛋白85

二、藻红蛋白的末源86

三、藻红蛋白与抗体免疫球蛋白结合物的制备86

四、藻红蛋白抗体结合物的应用88

第五章 免疫酶组织化学技术92

第一节 酶标记抗体的原理和制备方法92

一、原理92

二、标记酶的要求92

三、常用于标记的酶93

四、酶标记抗体的具体方法93

五、酶标记抗体的鉴定97

第二节 酶标记抗体染色方法98

一、基本原理98

二、染色步骤98

一、抗酶抗体法或称非标记抗体法100

第三节 非标记免疫酶组织化学技术100

二、PAP法102

三、放大抗体法104

四、半抗原结合抗体免疫酶染色方法104

第四节 可溶性PAP复合物的制备105

一、兔抗HRP血清的制备105

二、PAP复合物制备105

三、PAP复合物的贮存107

四、McAB PAP复合物制备107

第六章 免疫碱性磷酸酶技术108

第一节 碱性磷酸酶的性质108

第二节 碱性磷酸酶标记方法109

三、APAAP复合物的制备110

一、戊二醛一步法110

二、偶氮桥法110

第三节 碱性磷酸酶的免疫组化染色方法111

一、直接法112

二、间接法112

三、APAAP法113

四、生物素—亲和素-AKP系统113

五、有关试剂的配制114

第四节 免疫碱性磷酸酶方法和其他免疫组化方法的比较115

第五节 免疫碱性磷酸酶技术方法的选择及注意的问题116

第六节 免疫碱性磷酸酶技术的应用118

一、组织切片的免疫染色118

三、用于免疫印迹的显色反应119

四、酶联免疫吸附试验中的应用119

二、用于细胞膜表面抗原的免疫酶标检测119

五、用于免疫组化的双重或多重标记120

第七章 亲合免疫细胞组织化学技术122

第一节 概述122

第二节 卵白素—生物素系统123

一、生物素、亲和素的特性及作用原理123

二、生物素—卵白素系统用于免疫细胞化学标记技术的基本方法124

三、生物素—卵白素系统的优点125

第三节 有关试剂的制备126

一、亲和素的提取及纯化126

二、活化生物素的制备126

四、Avidin-HRP复合物的制备127

五、活化生物素HRP复合物的制备127

三、活化生物素偶联抗体方法127

第四节 卵白素—生物素系统的免疫组化染色128

一、ABC法128

二、快速ABC法129

三、二步ABC法129

四、PAP法和ABC法连续应用130

五、LAB法131

六、BRAB法132

第五节 应用133

一、树脂包埋切片的ABC染色133

二、涂片、离心细胞和细胞学标本ABC法染色133

三、ABC法在Lectin上的应用133

四、ABS试剂在ELISA中的应用134

五、生物素在核酸探针中的应用135

一、SPA的理化和免疫学性质136

第六节 葡萄球菌A蛋白136

二、SPA各种试剂的制备137

三、SPA的应用140

第八章 免疫胶体金技术144

第一节 胶体的基本概念144

第二节 胶体金的制备145

一、制备前的准备145

二、试剂及器材146

三、胶体金分散颗粒的制备146

第三节 胶体金探针制备149

一、待标记蛋白质和金溶胶的制备149

二、确定胶体金与待标记蛋白质用量比例150

三、胶体金与蛋白质的结合150

四、胶体金标记蛋白质的纯化152

五、胶体金标记蛋白质的质量鉴定153

第四节 免疫金染色法154

一、原理154

二、间接法染色步骤155

三、免疫金搭桥法染色步骤155

第五节 免疫金银法156

一、基本原理156

二、IGSS步骤156

三、双PAG法157

四、IGSS法的评价及其注意事项158

五、非特异背景及其清除方法160

六、银显影液的配制160

第六节 彩色免疫金银法161

第一节 概况163

第九章 免疫电镜技术163

一、标本处理164

第二节 免疫电镜技术的前处理和基本形式164

二、基本形式166

第三节 铁蛋白标记免疫电镜技术169

一、铁蛋白标记的原理和方法169

二、铁蛋白标记物的分辨率170

第四节 酶标记免疫电镜技术171

一、免疫电镜技术中酶标记方法的选择171

二、包埋前免疫过氧化物酶染色171

三、包埋后免疫过氧化物酶染色173

一、包埋前染色174

二、包埋后染色174

第五节 胶体金标记免疫电镜技术174

三、免疫胶体金扫描电镜技术177

四、免疫胶体金负染法177

五、复型免疫细胞化学技术177

六、冷冻蚀刻免疫电镜技术178

七、胶体金标记电镜水平的定量免疫细胞化学技术179

第六节 超微结构双重及多重免疫组化标记技术180

一、单面阻断法181

二、双面双重标记方法182

三、应用不同种动物产生的特异性抗体及相应的标记二抗的间接法182

四、标记抗原法183

五、电镜下多重免疫标记的试剂要求183

第一节 双重或多重免疫染色的基本方法185

一、基本形式185

第十章 免疫组织化学的双重和多重染色技术185

二、标记物及底物188

第二节 双重免疫荧光组化染色技术190

一、阻断法191

二、直接法192

三、间接法—异种动物抗体法192

四、间接法—同种动物抗体法192

五、藻红朊抗体结合物与其他荧光素标记抗体的双重或三重染色193

第三节 双重免疫酶组化染色方法194

一、阻断法195

二、非阻断法的单酶或双酶双重免疫染色197

三、其他形式组合的双重免疫染色方法198

一、单酶双重或多重标记染色200

第四节 双重或多重免疫组化标记的应用200

二、双酶双重免疫染色201

三、标记抗原双重免疫染色203

四、免疫金银法与免疫酶法的双重免疫染色203

五、三重免疫酶染色204

六、双重免疫酶与双重免疫荧光染色的比较205

七、双重原位分子杂交技术205

第十一章 免疫细胞组织化学方法学进展的评估及结果的判断209

第一节 免疫细胞组织化学方法进展及评估209

一、酶标记抗体法209

二、非标记抗体酶法209

三、生物素—抗生物素蛋白系统211

四、双PAP法及ABPAP法212

五、胶体金属—抗体复合物213

第二节 免疫组织化学染色结果的判断215

一、对照结果的正确判断215

二、怎样判断特异性染色结果217

第十二章 免疫组化染色对照的设计、非特异性染色及消除方法220

第一节 正确设计免疫组织化学染色对照的方法220

一、空白对照220

二、替代对照221

三、抑制对照221

四、吸收试验对照221

五、阳性对照222

六、自身对照222

一、免疫荧光组化染色中常见的非特异性荧光223

第二节 非特异性染色及消除方法223

二、消除免疫荧光染色中的非特异性染色方法225

三、内源性酶及消除方法226

四、IGSS中的非特异染色227

五、抗体引起的非特异性染色227

六、DAB氧化物229

第三节 显示系统及衬染剂的选择229

一、显示系统229

二、显示系统的增强方法231

三、衬染剂的选择233

第十三章 微波免疫组化染色技术及在病理中的应用235

第一节 微波技术的概况235

第二节 微波固定、脱水、透明及常规染色236

一、组织固定236

二、组织脱水239

三、微波染色方法240

第三节 微波电镜标本固定及染色241

第四节 微波免疫组化染色242

一、微波辐射的免疫荧光染色243

二、微波辐射的免疫酶标记染色244

三、作者实验室所用微波炉及染色流程248

四、应用微波免疫组化染色的注意事项249

第十四章 原位分子杂交技术252

第一节 核酸分子杂交技术概况252

第二节 核酸探针标记253

一、探针序列的选择253

二、探针类型254

三、探针标记原理和方法256

四、核酶探针标记物的选择264

第三节 组织切片上原位分子杂交265

一、杂交前的准备265

二、杂交268

三、检测270

四、杂交对照的设计272

五、举例273

第四节 电镜下原位分子杂交276

一、概况276

二、技术方法277

三、注意要点279

第五节 病理学中的应用279

一、病毒性疾病研究中的应用279

三、细胞生物合成及遗传疾病研究中的应用280

二、肿瘤研究中的应用280

第一节 概述284

一、PCR原理284

二、特点284

第十五章 聚合酶链式反应284

第二节 基本方法286

一、标准反应体系286

二、样品制备286

三、引物的选择和纯化287

四、缓冲液组成287

五、调温程序288

六、Taq DNA聚合酶用量288

七、影响特异性和敏感性的因素288

九、操作实例289

八、假阳性和假阴性289

十、遇到的问题及解决的办法290

第三节 应用291

一、遗传性疾病的产前诊断291

二、传染性疾病的诊断291

三、胎儿性别的鉴定292

四、司法鉴定292

五、DNA克隆和序列分析292

六、PCR在肿瘤研究中的应用293

第十六章 癌基因及蛋白产物在肿瘤中的表达及意义298

第一节 癌基因的概述298

一、什么是癌基因298

二、癌基因的命名298

三、抗癌基因300

第二节 癌基因的分类及生物学特征301

一、src癌基因族302

二、ras癌基因族303

三、myc及其他核内癌基因303

第三节 癌基因的激活及致癌机制308

一、癌基因的激活方式308

二、癌基因致癌机制309

第四节 癌基因的功能310

一、癌基因与细胞生长调节310

二、原癌基因与细胞分化调节312

第五节 癌基因蛋白产物在肿瘤中的表达及意义 蔹313

一、ras癌基因313

二、c-erbB—2癌基因314

三、P53抗癌基因315

四、c-myc癌基因表达蛋白产物320

五、检测癌基因及其产物的实用价值321

第十七章 肿瘤标记物325

第一节 上皮性肿瘤标记物326

一、角蛋白326

二、上皮膜抗原327

三、桥粒蛋白327

四、癌胚抗原327

五、组织多肽抗原328

六、前列腺特异性抗原329

七、甲胎蛋白329

九、血型物质330

八、甲状腺球蛋白330

第二节 间叶组织肿瘤标记物331

一、波纹蛋白331

二、结蛋白332

三、纤维连接蛋白332

四、第Ⅷ因子相关抗原333

五、溶菌酶334

六、α1—抗胰蛋白酶334

七、肌红蛋白334

八、肌动蛋白335

九、肌球蛋白336

十、细胞外基质蛋白337

一、胶质纤维酸性蛋白339

第三节 神经源性肿瘤标记物339

二、S-100蛋白340

三、神经丝蛋白340

四、神经元特异性烯醇化酶341

五、髓磷酯碱性蛋白342

六、突触囊泡蛋白和嗜铬颗粒蛋白342

七、碳酸酐酶C343

八、神经系统肿瘤的鉴别诊断343

第四节 内分泌肿瘤标记物344

一、脑垂体肿瘤标记物344

二、胰岛细胞肿瘤标记物344

三、甲状腺和甲状旁腺肿瘤标记物344

二、全白血细胞抗体345

三、全B细胞单抗345

一、免疫球蛋白345

第五节 淋巴瘤免疫组化标记物345

四、全T细胞单抗346

五、T细胞亚群单抗347

六、髓细胞/单核细胞标记物347

七、急性淋巴细胞性白血病共同抗原348

八、CD15348

九、CD30348

十、溶菌酶349

十一、末端脱氧核苷酸转移酶349

十二、组织相溶性复合物抗原349

一、人乳头瘤病毒354

第六节 病毒性肿瘤标记物354

二、单纯疱疹病毒355

三、乙型肝炎病毒355

四、EB病毒356

五、巨细胞病毒356

六、丙型肝炎病毒356

七、丁型肝炎病毒357

八、戊型肝炎病毒358

第七节 增殖细胞核抗原358

一、增殖细胞核抗原/周期素358

二、DNA多聚酶359

三、Ki-67单克隆抗体360

第八节 凝集素360

二、凝集素受体的标记方法361

三、凝集素在肿瘤研究、诊断中的应用361

一、简介361

第九节 雌、孕激素的检测及意义363

一、概况363

二、检测方法363

三、检测意义365

第十节 其他肿瘤标记物365

一、癌相关糖链抗原365

二、铁蛋白366

三、白蛋白366

四、酸性磷酸酶366

五、胎盘蛋白367

六、碱性磷酸酶367

七、组织胺酶367

八、醛缩酶367

十、α-干扰素368

九、抗肿瘤相关抗原TAG-72368

十一、白细胞介素Ⅱ受体369

附录373

一、缓冲液373

二、免疫动物及纯化蛋白质常用试剂378

三、玻璃及塑料器皿的硅烷化380

四、蛋白质含量的测定381

五、原位分子杂交常用试剂382

六、其他383

附表1 各种酸碱的强度385

附表2 白细胞相关抗原的分类386

附表3 常用特异性抗体的种类及用途阅览表391

附表4 常用试剂盒阅览表406

附表5 十二种生物素标记的凝集素407