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第一章背景知识1

分子杂交技术1

探针-靶分子的相互作用1

杂交技术新进展3

一般原则8

探针选择和特异性8

杂交速率8

探针浓度10

严格性10

杂交促进剂11

应用范围12

重组DNA实验室技术12

细菌检测12

病毒检测13

哺乳类序列14

参考文献15

第二章样品制备20

引言20

核酸的提取与沉淀20

方法2.1 DNA的苯酚抽提21

乙醇沉淀22

方法2.2 DNA的乙醇沉淀22

高分子量DNA的乙醇沉淀23

方法2.3 缠绕法分离高分子量DNA23

乙醇沉淀的替代方法24

DNA产率及纯度的测定24

血液DNA的提取24

方法2.4 肝素化全血中单核淋巴细胞的分离25

方法2.5 人血清中HBV DNA的提取26

血清DNA的提取26

血液白细胞核的快速分离26

组织DNA的提取27

方法2.6 新鲜或冰冻组织DNA的提取28

方法2.7 从石蜡包理的组织中提取DNA28

细菌DNA的提取29

方法2.8 细菌细胞DNA的提取29

RNA的提取30

RNA操作注意事项30

氧钒核糖核苷复合物-苯酚抽提法30

方法2.9 氧钒核糖核苷复合物（RVC）的制备31

方法2.10 细胞浆RNA的分离31

利用异硫氰酸胍分离RNA32

方法2.11 异硫氰酸胍分离RNA的方法Ⅰ33

方法2.12 异硫氰酸胍分离RNA的方法Ⅱ34

方法2.13 脲-氯化锂抽提RNA的方法35

方法2.14 多聚（A1）RNA的纯化36

其它来源样品核酸的提取37

粪便37

方法2.15 粪便标本的制备Ⅰ——DNA的提取38

方法2.16 粪便标本的制备Ⅱ——直接斑点印迹法38

尿液39

方法2.17 尿样CMV的提取39

其它样品40

原位杂交所用细胞和组织的制备41

封固细胞或组织之前载玻片的预处理41

方法2.18 载玻片的酸洗42

方法2.19 用APES预处理载玻片42

方法2.20 用聚L-赖氨酸预处理载玻片42

方法2.21 乙醇:乙酸固定43

用于原位杂交细胞的固定43

用于原位杂交细胞的制备43

方法2.22 4%副甲醛固定44

方法2.23 载玻片的福尔马林固定44

用于原位杂交的组织制备45

方法2.24 冷冻组织切片的制备45

方法2.25 组织的福尔马林固定与石蜡包理46

染色体原位杂交46

方法2.26 中期扩散相的制备47

方法2.27 吉姆萨（Giemsa）分带47

参考文献48

第三章放射性标记方法52

引言52

一般原则52

DNA的缺口平移55

通过酶学修饰标记DNA55

方法3.1 通过缺口平移用放射性核苷酸标记DNA56

DNA酶Ⅰ消解作用的优化57

通过随机引物标记DNA57

方法3.2 通过随机引物法用放射性核苷酸标记DNA59

从M13模板合成探针60

放射性标记的RNA探针61

方法3.3 35S标记RNA探针的转录62

寡核苷酸探针63

由寡脱氧核苷酸模板产生RNA探针63

方法3.4 从合成的单链寡核苷酸转录[35S]RNA探针63

接尾 寡核苷酸探针的制备64

方法3.5 利用末端脱氧核苷酸转移酶进行寡核苷酸接尾65

寡核苷酸5 端的标记65

其它标记方法66

方法3.6 用T4多聚核苷酸激酶标记5 端66

方法3.7 用TCA沉淀法测定比活性67

放射性标记探针的纯化68

凝胶过滤法68

方法3.8 利用Sephadex柱纯化标记探针68

方法3.9 利用QuiCkSpin柱纯化DNA69

标记探针的乙醇沉淀69

方法3.10 用乙醇沉淀纯化标记探针69

方法3.11 变性聚丙烯酰胺凝胶70

疏水层析—Nensorb柱71

方法3.12 用Nensorb柱纯化克隆的DNA71

方法3.13 三苯甲基寡核苷酸探针的纯化72

参考文献73

第四章非放射性标记方法75

引言75

酶学修饰77

方法4.1 通过缺口平移法用修饰的核苷酸标记DNA78

探针检查81

方法4.2 靶分子检查条的制备81

方法4.3 通过随机引物法用修饰核苷酸标记克隆的DNA82

克隆DNA片段的接尾82

方法4.4 用修饰核苷酸给克隆DNA片段接尾83

方法4.5 8-氨已基-dATP（AH—dATP）的合成85

生物素化的RNA探针86

方法4.6 RNA转录体中生物素核苷酸的掺入86

化学修饰87

用生物素进行化学标记88

方法4.7 DNA的光化生物素标记88

用半抗原进行化学标记89

方法4.8 DNA的光化DNP标记90

方法4.9A 光化DNP的合成91

方法4.9B DNP一二氨基已烷的合成92

DNA的连接臂修饰93

方法4.10 用亚硫酸氢盐和二氨基已烷修饰DNA93

溴介导的DNA修饰95

方法4.11 用溴和二氨基已烷修饰DNA96

寡核苷酸探针97

方法4.12 寡核苷酸探针的酶促接尾98

方法4.13 氨基一寡核苷酸探针的合成和纯化99

将检测基团加到氨基寡核苷酸上100

方法4.14 寡核苷酸探针的生物素标记101

酶联反应Ⅰ102

方法4.15 利用均一的双功能连接臂酶标寡核苷酸探针103

酶联反应Ⅱ105

方法4.16 利用非均一双功能连接臂酶标寡核苷酸探针105

参考文献106

第五章杂交方式和检测方法110

引言110

滤膜杂交111

斑点印迹杂交111

方法5.1 DNA的斑点印迹112

方法5.2 RNA的斑点印迹113

胞浆斑点杂交113

方法5.3 胞浆斑点杂交113

完整细胞的斑点印迹114

方法5.4 利用斑点印迹快速筛选培养细胞的DNA序列114

Southern印迹杂交115

琼脂糖凝胶电泳116

方法5.5 琼脂糖凝胶电泳116

方法5.6 Southern印迹转移至硝酸纤维素膜117

方法5.7 DNA从琼脂糖转移至尼龙膜118

Southern转移至尼龙膜118

RNA的Northern印迹119

方法5.8 RNA的羟甲基汞凝胶电泳和转移条件120

方法5.9 RNA的甲醛凝胶电泳和转移条件121

菌落和噬斑筛选122

方法5.10 从平板上复制克隆122

方法5.11 裂解细胞并将DNA固定到滤膜上123

滤膜杂交方法124

方法5.12 滤膜与放射性标记探针的杂交124

放射自显影125

方法5.13 放射自显影126

滤膜的再探测126

非放射性滤膜杂交条件127

方法5.15 非放射性探针的一般滤膜杂交条件127

方法5.14 从滤膜上洗脱放射性标记的探针127

半抗原检测129

方法5.16 滤膜上半抗原标记探针的比色检测129

生物素检测130

方法5.17 滤膜上生物素标记探针的一步法比色检测130

替代方法131

方法5.18 滤膜上生物素标记探针的两步法比色检测131

化学发光检测132

方法5.19 滤膜的化学发光检测132

过氧化物酶的检测132

碱性磷酸酶的检测133

方法5.20 尼龙膜上生物素标记探针的去除133

原位杂交133

方法5.21 用Denhardt溶液预处理载玻片135

方法5.22 使用非放射性探针时福尔马林固定、石蜡包埋载玻片的预处理136

预杂交137

杂交137

方法5.23 使用33S标记探针的原位杂交137

杂交后处理138

放射自显影139

载玻片染色139

方法5.24 杂交后载玻片的苏木精染色139

方法5.25 使用半抗原或生物素标记探针的原位杂交140

方法5.26 半抗原标记探针的显色141

方法5.27 生物素标记探针的显色141

检测溶解的靶分子的杂交方式142

亲和捕捉142

均质溶液杂交测定143

夹心式（sandwich）杂交146

方法5.29 微滴度孔中的夹心杂交147

微滴度孔的准备148

夹心杂交149

预杂交（8孔）149

孔条显色150

其它方式153

参考文献154

第六章探针和靶分子扩增系统159

引言159

靶核酸扩增159

聚合酶链式反应159

方法6.1 用于PCR的样品制备方法162

方法6.2 从全血中快速制备PCR样品162

方法6.3 利用PCR酶促扩增靶DNA163

产物的杂交分析163

基于转录的扩增系统165

探针扩增166

Qβ复制酶系统166

探针网络167

参考文献168

附录A试剂171

缓冲液和试剂171

配制方法174

方法A.1 杂交缓冲液的大量制备174

方法A.2 用于碱性磷酸酶的NBT和BCIP底物溶液175

方法A.3 用于碱性磷酸酶的INT和BCIP底物溶液176

方法A.4 用于碱性磷酸酶的坚牢红底物176

方法A.5 乙酰化牛血清清蛋白（BSA）的制备177

方法A.6 5×接尾缓冲液的配制177

参考文献178

DNA换算表178

换算系数178

核苷酸的消光系数179

换数公式179

DNA和RNA的定量179

米制前缀179

DNA的编码能力179

缩略语表180

附录B其它方法181

方法B.1 兔抗DNP抗体的制备181

NHS-氨基已酸-DNP的合成181

DNP-BSA的制备182

家兔的免疫182

血清的处理182

方法B.2 碱性磷酸酶与抗体的结合183

方法B.3 FITC-二氨基已烷的合成184

方法B.4 FITC与BSA的偶联184

参考文献185

附录C 国外厂商地址及产品介绍186