《重组DNA的原理和方法》求取 ⇩

常用名词缩写1

第1章分子克隆的工具酶1

1.1 限制酶1

1.1.1 限制酶的发现和命名1

1.1.2 Ⅰ型和Ⅲ型限制酶2

1.1.3 Ⅰ型限制酶2

1.1.4 DNA甲基化6

1.1.4.1 用常用的E.coli菌株进行甲基化6

1.1.4.2 用甲基化酶进行甲基化8

1.1.4.3 甲基化对DNA图谱分析的影响16

1.1.5 限制酶酶切反应17

1.1.5.1 酶切反应注意事项17

1.1.5.2 酶切反应21

1.1.5.3 酶切反应中常见问题22

1.1.5.4 酶切产物的连接24

1.2 分子克隆中的其他酶25

1.2.1 酶的用途及反应条件25

1.2.2.1 T4 DNA连接酶28

1.2.2 连接酶28

1.2.2.2 E.coli DNA连接酶29

1.2.2.3 T4 RNA连接酶29

1.2.3 聚合酶29

1.2.3.1 DNA聚合酶Ⅰ30

1.2.3.2 Klenow片段31

1.2.3.3 T4 DNA聚合酶32

1.2.3.5 修饰的T7 DNA聚合酶33

1.2.3.6 Taq DNA聚合酶33

1.2.3.4 T7 DNA聚合酶33

1.2.3.7 DNA末端转移酶34

1.2.3.8 反转录酶34

1.2.3.9 E.coli RNA聚合酶36

1.2.3.10 噬菌体SP6.T7和T3RNA聚合酶36

1.2.3.11 多聚(A)聚合酶37

1.2.3.12 鸟苷酸转移酶37

1.2.4 核酸酶37

1.2.4.1 绿豆核酸酶37

1.2.4.2 核酸酶S?37

1.2.4.4 DNA酶Ⅰ38

1.2.4.3 核酸外切酶Ⅲ38

1.2.4.6 λ噬菌体核酸外切酶39

1.2.4.5 核酸酶BAL3139

1.2.4.7 λ末端酶40

1.2.4.8 尿嘧啶N-糖基酶40

1.2.4.9 RNA酶H40

1.2.4.10 RNA酶A40

1.2.5 激酶和磷酸酶41

1.2.5.1 T4多核苷酸激酶41

1.2.4.11 RNA酶T141

1.2.5.2 碱性磷酸酶42

1.2.5.3 氯霉素乙酰转移酶42

1.2.6 DNA结合蛋白42

1.2.6.1 单链DNA结合蛋白(SSB)42

1.2.6.2 RecA蛋白43

1.2.6.3 拓扑异构酶Ⅰ43

2.1.3 电泳环境44

2.1.1 样品44

2.1.2 电场44

第2章凝胶电泳44

2.1 影响凝胶电泳迁移率的因素44

2.2 凝胶电泳的类型45

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳45

2.2.1.1 琼脂糖凝胶性质45

2.2.1.2 电泳装置45

2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳46

2.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶的性质46

2.2.1.4 凝胶浓度的选择46

2.2.1.3 电泳缓冲液46

2.2.2.2 电泳装置47

2.2.2.3 凝胶浓度的选择47

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳48

2.3.1 常规琼脂糖凝胶电泳48

2.3.2 微型琼脂糖凝胶电泳49

2.3.3 碱性琼脂糖凝胶电泳50

2.3.4 脉冲凝胶电泳51

2.3.4.1 脉冲凝胶电泳的原理及装置51

2.3.4.2 脉冲凝胶电泳DNA的制备53

2.4 RNA琼脂糖凝胶电泳54

2.3.4.3 脉冲电场凝胶电泳54

2.4.1 戊二醛变性电泳55

2.4.2 甲醛变性电泳56

2.5 DNA聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳57

2.5.1 未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳57

2.5.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳59

2.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的常见问题及解决办法60

2.6.1 非变性圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA61

2.6 RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳61

2.6.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA62

2.6.2.1 甲酰胺凝胶63

2.6.2.2 尿素凝胶64

2.7 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳64

2.7.1 SDS聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳64

2.7.2 非变性不连续凝胶电泳65

2.7.3 蛋白质染色检测66

2.7.3.1 考马斯亮蓝染色66

2.7.3.2 银染66

2.7.3.3 其他蛋白质染色方法67

2.8.1 凝胶干燥68

2.8.1.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥68

2.8.1.2 测序聚丙烯酰胺凝胶的干燥68

2.8 放射自显影和荧光自显影检测68

2.8.2.1 预曝光X光片69

2.8.2.2 放射自显影69

2.8.3 荧光自显影69

2.8.2 放射自显影69

2.8.1.3 琼脂糖凝胶的干燥69

2.9 从凝胶中回收和纯化生物大分子70

2.9.1 DNA的回收70

2.9.1.1 压碎浸泡法70

2.9.1.2 透析袋电洗脱法71

2.9.1.3 低熔点琼脂糖凝胶法71

2.9.1.4 DEAE-纤维素膜法72

2.9.1.5 琼脂糖酶法73

2.9.1.6 回收DNA的纯化处理73

2.9.2 RNA的回收74

2.10 凝胶电泳中常见的问题75

2.9.3 蛋白质的回收75

第3章常用载体78

3.1 质粒78

3.1.1 质粒的性质78

3.1.1.1 质粒的复制78

3.1.1.2 质粒的不相容性79

3.1.1.3 选择标记79

3.1.1.4 移动性80

3.1.1.5 质粒的分类80

3.1.2.1 插入失活筛选81

3.1.2.2 α互补筛选81

3.1.1.6 质粒载体的优缺点81

3.1.2 常用筛选方法81

3.1.2.3 直接筛选82

3.1.2.4 限制酶图谱筛选82

3.1.2.5 表达筛选83

3.1.2.6 核酸探针筛选83

3.1.3.4 pKK223-284

3.1.3.3 pGEM-3Z84

3.1.3.2 pUC1884

3.1.3 常用质粒载体图谱84

3.1.3.1 pBR32284

3.1.3.5 nAN1385

3.2 λ噬菌体85

3.2.1 λ噬菌体的性质85

3.2.1.1 λ噬菌体基因组85

3.2.1.2 裂解生长86

3.2.1.3 溶源生长88

3.2.1.4 选择λ噬菌体载体和宿主88

3.2.2.2 cI基因插入失活筛选90

3.2.2.3 Spi筛选90

3.2.1.5 λ噬菌体的优缺点90

3.2.2.1 α—互补筛选90

3.2.2 常用筛选方法90

3.2.2.4 包装片段筛选91

3.2.2.5 同源重组筛选91

3.2.2.6 用表达载体筛选92

3.2.2.7 核酸探针筛选92

3.2.3 常用λ噬菌体载体图谱92

3.2.3.6 λZAP/R93

3.3 丝状噬菌体93

3.2.3.5 λDASH93

3.3.1 丝状噬菌体的性质93

3.3.1.1 丝状噬菌体的性质93

3.2.3.3 λgt1093

3.2.3.2 EMBL393

3.2.3.1 卡龙4093

3.2.3.4 λgt1193

3.3.1.2 丝状噬菌体载体的优缺点95

3.4 噬粒97

3.4.1 噬粒的性质97

3.4.1.1 噬粒的组成97

3.3.3 常用单链噬菌体载体图谱97

3.3.2 常用筛选方法97

3.4.1.2 噬粒载体的优缺点98

3.4.2 载体的使用98

3.4.3 常用噬粒载体图谱98

3.4.3.1 pUC11898

3.4.3.2 pGEM-3Zf99

3.4.3.3 pBS SK99

3.4.3.4 M13KO799

3.5 粘粒99

3.5.1 粘粒的性质99

3.5.1.1 粘粒的组成99

3.5.1.2 粘粒中克隆100

3.5.1.3 粘粒载体的优缺点101

3.5.2 载体的使用102

3.5.2.1 双酶切载体定向克隆102

3.5.2.2 双cos位点载体克隆102

3.5.2.3 体内重组102

3.5.3 常用粘粒载体图谱105

3.5.3.3 pWE15106

3.6 卡粒106

3.6.1 卡粒的性质106

3.5.3.2 c2RB106

3.5.3.1 pJB8106

3.6.2 载体的使用107

3.6.3 常用卡粒载体图谱107

3.7 酵母克隆载体107

3.7.1 酵母载体的性质107

3.7.2 用酵母载体克隆109

3.7.3 常用酵母载体图谱110

3.7.3.1 YIp5110

3.7.3.2 YRp7110

3.7.3.3 YEp24110

3.8.1 植物克隆载体的性质111

3.8 植物克隆载体111

3.7.3.4 Ycp50111

3.7.3.5 YAC3111

3.7.3.6 pJS97/pJS98111

3.8.2 常用植物载体图谱112

3.8.2.1 pGV3850112

3.8.2.2 Bin19112

3.9 动物细胞克隆载体113

第4章DNA的制备115

4.1 质粒DNA的分离纯化115

4.1.1 简介115

4.1.2.2 碱裂解法117

4.1.2 微量提取质粒DNA117

4.1.2.1 煮沸法117

4.1.2.3 96-孔微量滴定板法118

4.1.2.4 直接测定菌落中质粒大小118

4.1.3 大量提取质粒DNA119

4.1.3.1 细菌的收集119

4.1.3.2 碱裂解法119

4.1.3.3 煮沸法120

4.1.3.4 Triton裂解法120

4.1.4.1 PEG沉淀法121

4.1.4 纯化质粒DNA121

4.1.4.2 氯化绝/澳化乙锭平衡高心法122

4.2 λ噬菌体DNA的分离纯化123

4.2.1 λ噬菌体的噬菌斑纯化123

4.2.1.1 通过系列稀释滴定分离单噬菌斑123

4.2.1.2 通过划线接种法分离单噬菌斑124

4.2.1.3 挑取λ噬菌斑124

4.2.2.1 平板裂解法125

4.2.2.2 液体裂解法125

4.2.2 制备λ噬菌体原液125

4.2.2.3 噬菌体裂解液的保存126

4.2.3 制备噬菌体DNA126

4.2.3.1 从大量液体裂解物中制备DNA126

4.2.3.2 从少量液体裂解物中制备DNA127

4.3 单链噬菌体DNA的分离纯化128

4.3.1 M13噬菌体的噬菌斑纯化128

4.3.2 M13噬菌体单链DNA的制备128

4.4.1.1 微量制备法129

4.4.1 细菌基因组DNA的制备129

4.4 染色体DNA的分离纯化129

4.3.3 M13噬菌体双链DNA的制备129

4.4.1.2 大量制备法130

4.4.1.3 从基因组DNA制备液中除去存在的多糖131

4.4.2 从植物组织提取基因组DNA131

4.4.3 从哺乳动物组织提取基因组DNA132

4.4.4 琼脂糖凝胶电泳133

4.4.5 DNA蔗糖梯度分级分离133

4.5 用有机溶剂抽提、纯化和浓缩核酸134

4.5.1 酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀纯化核酸134

4.6 核酸色谱135

4.5.2 用正丁醇浓缩DNA135

4.5.3 乙醇沉淀除去低分子量的寡核苷酸和三磷酸135

4.6.1 羟磷灰石柱分离单链和双链核酸137

4.6.2 凝胶过滤色谱137

4.6.2.1 Sephadex的制备137

4.6.2.2 常规柱色谱137

4.6.2.3 离心柱色谱137

4.6.2.4 Sepharose CL-4B分级分离cDNA138

5.1 RNA的制备139

5.1.1 制备RNA时的注意事项139

第5章RNA的制备和分析139

5.1.2 细菌RNA的制备140

5.1.2.1 从革兰氏阳性细菌中分离RNA140

5.1.2.2 从革兰氏阴性细菌中快速分离RNA141

5.1.3 动物细胞RNA制备142

5.1.3.1 从培养细胞制备总RNA142

5.1.3.2 从组织中制备总RNA143

5.1.3.3 从培养细胞中制备细胞质RNA143

5.1.4 植物细胞RNA制备144

5.1.5.1 寡聚(dT)纤维素纯化mRNA146

5.1.5 多聚(A)RNA的纯化146

5.1.5.2 生物素标记寡聚(dT)纯化mRNA147

5.1.5.3 用DNA纯化特定的mRNA147

5.1.6 分级分离RNA148

5.1.6.1 羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳148

5.1.6.2 羟甲基汞蔗糖梯度离心149

5.1.7 RNA制品的质量150

5.2 RNA分析150

5.2.1 S1分析151

5.2.1.1 M13单链模板法151

5.2.1.3 寡核苷酸探针法154

5.2.1.2 质粒双链模板法154

5.2.1.4 mRNA S1定量分析的条件155

5.2.1.5 S1分析经常出现的问题156

5.2.2 RNA酶保护分析156

5.2.2.1 RNA酶保护分析156

5.2.2.2 凝胶电泳纯化RNA探针159

5.2.3 引物延伸159

5.2.4 Northern杂交161

5.2.4.1 RNA甲醛变性电泳161

5.2.5 斑点杂交163

5.2.4.2 RNA乙二醛/DMSO变性电泳163

第6章DNA文库的构建165

6.1 构建文库需考虑的问题165

6.1.1 载体166

6.1.2 外源DNA166

6.1.3 外源DNA片段与载体连接167

6.1.4 重组DNA导入E.coli169

6.1.5 文库筛选及保存169

6.2 构建基因组文库169

6.2.1 载体169

6.2.2 外源片段170

6.2.2.1 基因组DNA文库的构建171

6.2.2.2 磷酸酶处理过的噬菌体臂包装效率的测定171

6.2.3 构建基因组文库的特殊方法172

6.2.3.1 部分填补法172

6.2.3.2 精简基因组文库173

6.2.4 构建基因组文库中常见的问题174

6.3 构建cDNA文库174

6.3.1 mRNA的数量和质量174

6.3.2.1 cDNA第一链的合成175

6.3.2 cDNA的合成175

6.3.2.2 cDNA第二链的合成176

6.3.2.3 cDNA合成效率的测定179

6.3.3 cDNA克隆180

6.3.3.1 利用接头克隆180

6.3.3.2 利用引物-转接头克隆180

6.3.3.3 同聚尾克隆180

6.3.3.4 Okayama-Berg载体克隆181

6.3.3.5 单链载体中克隆181

6.3.3.6 mRNA-cDNA克隆182

6.3.4 精简cDNA文库186

6.3.4.1 精简DNA文库的建立187

6.3.5 cDNA克隆中常见的问题189

6.4 文库的扩增和贮存189

6.4.1 λ噬菌体文库的扩增189

6.4.2 粘粒文库的扩增192

6.4.2.1 粘粒和质粒基因文库的扩增192

6.5 文库的筛选193

6.5.1 文库的转移和复制193

6.5.1.1 λ噬菌体文库的转移193

6.5.1.2 粘粒及质粒文库的转移194

6.5.2 杂交筛选195

6.5.2.1 用DNA片段作为探针195

6.5.2.2 在甲酰胺溶液中杂交195

6.5.2.3 用人工合成的寡核苷酸作为探针196

6.6 亚克隆198

6.6.1 DNA片段的亚克隆199

6.6.2 用低熔点琼脂糖亚克隆200

7.1 E.coli的转化201

7.1.1 CaCl2制备感受态E.coli细胞及其转化201

第7章重组DNA导入宿主201

7.1.2 电激高效转化202

7.2 λ噬菌体体外包装204

7.2.1 从一种溶源菌中制备包装提取物及包装205

7.2.2 从两种溶源菌中制备包装提取物及包装206

7.2.2.1 超声波提取物的制备206

7.2.2.2 冻融裂解物的制备207

7.2.2.3 体外包装207

7.3.2 插入方向的确定208

7.3.1 噬菌体DNA导入细胞208

7.3 单链噬菌体转染208

7.4 酵母细胞的转化209

7.4.1 原生质体法转化酵母209

7.4.2 乙酸锂法转化酵母210

7.5 动物细胞的转化210

7.5.1 磷酸钙转染法211

7.5.2 DEAE-葡聚糖转染法212

7.5.2.1 用DEAE-葡聚糖转染细胞212

7.5.2.2 大量细胞的DEAE-葡聚糖转染213

7.5.2.3 悬浮细胞的DEAE-葡聚糖转染214

7.5.3.1 动物细胞电激转染法215

7.5.3 电激法215

7.5.3.2 植物原生质体电激转染法216

7.5.4 脂质体转染法216

7.5.4.1 用脂质体进行瞬时表达216

7.5.4.2 用脂质体进行稳定转化217

7.5.5 转染方法的优化218

7.6 植物细胞的转化220

7.6.1 农杆菌介导的植物细胞转化220

7.6.1.1 培养法220

7.6.1.2 叶盘法221

7.6.1.3 活体接种与共感染法222

7.6.2 利用PEG的植物细胞转化224

第8章基因表达226

8.1 基因在E.coli细胞中表达226

8.1.1 表达戴体结构226

8.1.2 融合蛋白表达戴体227

8.1.2.1 表达融合蛋白的优点及其载体227

8.1.2.2 表达载体的构建和融合蛋白的检测227

8.1.2.3 制备用于产生抗体的融合蛋白228

8.1.3.1 原核基因的表达载体229

8.1.3 天然蛋白表达载体229

8.1.3.2 真核基因的表达载体231

8.1.4 其他表达载体232

8.1.4.1 分泌型表达载体232

8.1.4.2 切割型表达载体234

8.1.5 提高表达效率235

8.1.6 检测基因表达235

8.1.6.1 检测基因表达的方法235

8.2 基因在哺乳动物中表达236

8.2.1 哺乳动物表达系统的用途236

8.1.6.2 用β半乳糖苷酶活性检测表达236

8.2.2 哺乳动物表达载体237

8.2.2.1 原核DNA序列237

8.2.2.2 启动子237

8.2.2.3 增强子237

8.2.2.4 拼接信号237

8.2.2.5 终止信号和多聚腺苷化信号238

8.2.2.6 筛选标记238

8.2.2.7 真核病毒序列240

8.2.3 几种常见的真核病毒载体240

8.2.3.1 SV40载体240

8.2.3.2 BPV载体242

8.2.3.3 EBV载体243

8.2.3.4 反转录病毒载体243

8.2.3.5 痘病毒载体244

8.2.4 外源DNA序列246

8.2.5 宿主与载体系统246

8.2.5.1 瞬时表达系统247

8.2.5.2 稳定表达系统247

8.2.5.3 转染DNA的扩增和诱导248

8.2.7 融合基因的用途250

8.2.6 转染方法250

8.3 用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达基因253

8.3.1 杆状病毒生活周期254

8.3.2 杆状病毒表达系统255

8.3.3 用杆状病毒表达系统大量表达蛋白质255

第9章核酸方法筛选鉴定重组子257

9.1 构建DNA酶切图谱257

9.1.1 双酶切法257

9.1.2 部分酶切法258

9.1.3 BAL 31酶切法261

9.2 探针的制备262

9.1.4 双向电泳末端标记法262

9.2.1 双链DNA探针263

9.2.1.1 切口平移法263

9.2.1.2 随机引物合成法265

9.2.2 单链DNA探针266

9.2.2.1 从M13载体衍生序列合成探针266

9.2.2.2 从RNA合成单链cDNA探针267

9.2.3 末端标记DNA探针268

9.2.3.2 前向反应标记5＇末端269

9.2.3.1 Klenow片段标记3＇末端269

9.2.3.3 交换反应标记5＇末端271

9.2.4 寡核苷酸探针272

9.2.4.1 寡核苷酸探针的类型及标记方法272

9.2.4.2 T4多核苷酸激酶标记寡核苷酸273

9.2.4.3 乙醇沉淀纯化放射性标记寡核苷酸274

9.2.4.4 酸沉淀法测定DNA和KNA中的放射强度275

9.2.4.5 柱色谱分离放射性标记的DNA276

9.2.5 RNA探针276

9.2.6.1 生物素标记探针277

9.2.6.2 地高辛配基标记探针277

9.2.6 非放射性探针277

9.2.6.3 辣根过氧化物酶标记探针278

9.3 分子杂交278

9.3.1 简介278

9.3.1.1 分子杂交种类278

9.3.1.2 反应条件对杂交的影响278

9.3.2 Southern杂交280

9.3.2.1 简介280

9.3.2.2 Southern转移和杂交方法281

9.3.5 菌落原位杂交285

9.3.5.1 菌落原位杂交285

9.3.4 斑点杂交285

9.3.3 Northern杂交285

9.3.5.2 λ噬菌斑原位杂交287

9.4 基因在染色体上定位288

9.4.1 染色体跳移288

9.4.2 染色体步移290

9.4.3 染色体缓移290

第10章蛋白质检测和分析292

10.1 蛋白质抽提292

10.2.2 Lowry方法293

10.2 蛋白质定量293

10.2.1 Bradford方法293

10.3 常规色谱294

10.3.1 凝胶过滤294

10.3.2 离子交换色谱297

10.3.3 亲和色谱300

10.3.4 疏水相互作用色谱302

10.3.5 纸上分配色谱302

10.3.6 液液分配色谱302

10.3.7 共价色谱302

10.3.9 常规色谱问题处理303

10.3.8 金属螯合色谱303

10.4 高效液相色谱304

10.4.1 反相高效液相色谱304

10.4.2 离子交换高效液相色谱306

10.4.3 体积排阻高效液相色谱308

10.4.4 高效聚焦色谱309

10.4.5 高效疏水相互作用色谱309

10.5 抗体的制备309

10.5.1 多克隆抗体的制备310

10.5.1.1 肌肉注射免疫311

10.5.1.3 皮下免疫312

10.5.1.2 皮肉免疫312

10.5.1.4 从耳动脉放血313

10.5.2 利用合成多肽制备抗体313

10.5.3 单克隆抗体的制备314

10.5.4 抗体的纯化315

10.5.4.1 蛋白A纯化315

10.5.4.2 细胞抽提物吸附纯化316

10.6.1 免疫沉淀318

10.6 免疫学测定318

10.6.1.1 放射性标记表达目的蛋白质的细胞319

10.6.1.2 裂解细胞320

10.6.1.3 收集纯化抗原-抗体复合物322

10.6.1.4 凝胶电泳和放射自显影分析323

10.6.2 酶联免疫吸附测定法324

10.6.2.1 辣根过氧化物酶标记抗体325

10.6.2.2 ELISA326

10.6.3 固相放射免疫测定328

10.6.3.1 氯胺T碘化标记抗体329

10.6.3.2 双抗体固相放射免疫测定330

10.6.4 Western印迹331

10.6.4.1 Western印迹332

10.6.4.2 固定在滤膜上蛋白质的染色333

10.6.5 荧光标记法334

10.6.6 免疫检测中常见问题的处理334

10.7 克隆基因的体外转录和体外翻译337

11.1 双脱氧链末端终止法341

11.1.1 简介341

第11章核酸测序341

11.1.2 反应前的准备343

11.1.2.1 反应的设计343

11.1.2.2 反应的材料343

11.1.3 测序的策略345

11.1.3.1 随机法345

11.1.3.2 互套缺失法346

11.1.3.3 引物延伸法353

11.1.4 模板的制备354

11.1.4.1 单链噬菌体模板的制备354

11.1.5 双脱氧链终止反应355

11.1.4.2 变性双链模板的制备355

11.1.6 凝胶电泳和放射自显影356

11.1.7 双脱氧测序法中常见问题358

11.2 化学法360

11.2.1 简介360

11.2.2 反应前的准备361

11.2.3 模板的制备363

11.2.4 化学裂解反应363

11.3.1 化学发光测序366

11.3 其他测序方法366

11.2.5 化学测序法中常见问题366

11.3.2 多重测序367

11.3.3 自动测序367

11.3.4 用PCR测序367

11.3.5 磁铁珠分离单链测序368

第12章定位诱变369

12.1 缺失诱变369

12.1.1 简单缺失369

12.1.2.3 DNA酶Ⅰ370

12.1.2.2 BAL 31370

12.1.2.1 核酸外切酶Ⅲ370

12.1.2 系统缺失370

12.1.2.4 T4 DNA聚合酶371

12.2 插入诱变371

12.2.1 简单插入371

12.2.2 系统插入372

12.2.2.1 在Mn2+存在下DNA酶?酶切后插入诱变372

12.2.2.2 接头扫描诱变372

12.2.2.3 TAB接头诱变375

12.3.1 诱变寡核苷酸的设计376

12.3 利用寡核苷酸诱变376

12.3.2 目的DNA模板的制备377

12.3.2.1 单链目的DNA模板的制备377

12.3.2.2 双链目的DNA模板的制备378

12.3.3 合成DNA突变体378

12.3.3.1 双引物法378

12.3.3.2 异源双链法379

12.3.3.3 核酸外切酶法380

12.3.3.4 盒式诱变法381

12.3.4 筛选突变体382

12.3.5 提高诱变效率383

12.3.5.1 利用尿嘧啶进行诱变384

12.4 酶法合成诱变386

12.3.5.2 利用α-硫代dNTP诱变386

12.5 随机化学诱变389

12.5.1 化学诱变剂389

12.5.1.4 肼诱变390

12.5.2 化学诱变中的注意事项390

12.5.1.5 弱酸诱变390

12.5.2.1 载体损伤390

12.5.1.3 亚硫酸盐诱变390

12.5.1.2 羟胺诱变390

12.5.1.1 亚硝酸诱变390

12.5.2.2 突变的分布391

12.5.2.3 目的片段的选择391

12.5.2.4 载体的选择391

第13章聚合酶链反应(PCR)393

13.1 PCR的用途393

13.2 PCR的过程394

13.2.1 原理394

13.2.2 反应成分394

13.2.2.1 引物394

13.2.2.3 反应缓冲液395

13.2.2.2 Taq DNA聚合酶395

13.2.2.4 模板DNA396

13.2.2.5 其他成分396

13.2.3 反应参数396

13.2.4 注意事项398

13.3 PCR方法399

13.3.1 快速扩增cDNA末端399

13.3.2 反向PCR401

13.3.3 用简并引物扩增cDNA401

13.3.4 定量PCR401

13.3.5 不对称PCR402

13.3.6 引物竞争PCR403

13.4 利用PCR进行分子克隆403

13.4.1 利用PCR进行重组和诱变403

13.4.2 利用PCR扩增RNA406

13.4.3 利用PCR测序407

13.4.3.1 常规PCR测序407

13.4.3.2 不对称PCR测序408

13.4.4 利用PCR定量DNA409

1 实验室的安全411

附录411

2分子生物学实验室设备416

3 常用培养基及菌株418

3.1 细菌培养基418

3.1.1 液体培养基418

3.1.2 固体培养基420

3.2 λ噬菌体工作溶液421

3.3 酶母培养基422

3.4 植物基本培养基422

3.5 常用E.coli菌株及基因型424

3.6 常用抗菌素426

4 常用试剂427

4.1 常用溶液427

4.2 其他酶制品430

4.3 常用酶反应缓冲液431

5 常用数据433

5.1 核酸和蛋白质常数433

5.1.1 常用数据及转换433

5.1.2 三磷酸核苷酸分子量433

5.1.3 氨基酸分子量434

5.1.5 常用核酸和蛋白质分子量标准物435

5.1.4 遗传密码435

5.1.6 各种生物基因组长度436

5.2 同位素数据437

5.3 Tris·Cl 缓冲液pH值与温度关系437

6 常用方法438

6.1 细菌的培养和生长438

6.1.1 细菌的液体培养438

6.1.2 细菌的固体培养438

6.2 器皿硅烷化439

6.1.4 E.coli细胞常用数据439

6.1.3 菌株保存和复壮439

6.3 放射自显影440

6.4 透析袋的处理440

6.5 核酸常用方法441

6.5.1 DNA和RNA的定量441

6.5.2 核酸的抽提和沉淀441

6.5.3 核酸浓缩441

6.5.4 放射性测定441

参考文献443