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第一章基本技术1

第一节 质粒DNA的快速制备方法1

实验一 咸-表面活性剂法1

实验二 煮沸法7

第二节 利用氯化铯-溴化乙锭超速离心分离质粒DNA9

第三节 采用Sepharose4B柱分离质粒DNA12

第四节 凝胶电泳16

实验一 水平型琼脂糖凝胶电泳17

实验二 垂直型琼脂糖凝胶电泳20

实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳21

实验四 微型凝胶电泳23

第五节 DNA的溴化乙锭染色及染色DNA的确认25

实验一 电泳后凝胶染色26

实验二 在凝胶中预先加入溴化乙锭的方法27

二、染色DNA的确认27

第六节 凝胶中DNA的回收28

实验一 电洗脱到DEAE（二乙氨基乙基纤维素）滤纸上的方法28

实验二 电洗脱到凝胶凹槽的方法30

实验三 冻结压榨法31

实验四 醋酸铵法32

实验五 透析袋法33

实验六 玻璃粉洗脱法35

第七节 DNA的纯化36

实验一 DNA的精胺纯化法37

实验二 用Nensorb柱纯化DNA38

实验三 用Elutip柱纯化DNA39

第八节 DNA的限制性内切酶酶切处理40

第九节 核酸杂种的形成——遗传同源性的确定45

实验一 Southern印迹法47

实验二 菌落杂交法或斑点杂交法53

第十节 DNA的标记55

一、缺口平移法56

实验一 利用大肠杆菌DNA聚合酶Iklenow片段或T4DNA多聚酶进行3＇-末端标记（添加反应或置换合成反应）60

二、末端标记法60

实验二 用末端脱氧核苷转移酶进行3＇-末端标记64

实验三 5＇-末端标记法65

三、非放射性探针67

第十一节 放射自显影和X射线胶片显影72

实验一 放射自显影72

实验二 荧光显影73

实验三 X射线胶片显影74

第十二节 细菌的转化74

一、直核细胞mRNA的制备与分离77

第十三节 RNA实验方法77

二、真核细胞总RNA的制备80

实验一 异硫氰酸胍法制备总DNA81

实验二 微量法制备RNA82

三、互补链DNA（cDNA）的合成83

四、变性凝胶的制备86

实验一 加入氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶87

实验二 加入甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶87

实验三 加入7mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝胶88

五、Northern印迹法89

实验一 用斑点印迹仪进行印迹分析91

六、标记探针与RNA样品的斑点杂交法91

实验二 不用斑点印迹仪进行印迹分析93

第十四节 真核细胞DNA的制备94

实验一 真核细胞DNA的快速制备方法94

实验二 真核细胞DNA的一般制备方法95

第十五节 DNA碱基序列的确定97

实验一 Sanger法（双脱氧链终止法98

实验二 Maxam-Gilbert法（化学法）102

第一节 概述106

一、M13载体106

第二章噬菌体的基因克隆106

二、λ噬菌体载体108

三、粘性质粒载体111

第二节 噬菌体DNA的制备111

一、噬菌体的噬菌斑纯化111

二、噬菌体DNA的制备与纯化113

第三节 λ噬菌体的基因克隆116

一、噬菌体载体的制备116

实验一 Charon28载体的制备116

实验二 EMBL 3载体的制备118

二、基因组DNA连接到噬菌体载体上并包装形成文库120

三、文库的滴定与平板培养126

四、利用放射性标记探针筛选文库127

五、文库的扩增130

第四节 cDNA克隆到λgt10和λgt11中131

一、克隆载体的制备131

实验一 λgt10克隆载体的制备131

实验二 λgt11克隆载体的制备133

二、cDNA文库连接和包装进λgt10或λgt11载体中135

三、λgt10和λgt11包装插入物的接种与筛选140

实验一 λgt10包装插入物的接种与筛选140

实验二 λgt11包装插入物的接种与筛选142

四、由λgt10和λgt11 cDNA克隆制备DNA143

五、插入片段亚克隆到pBR322中145

第五节 M13的基因克隆147

一、M13载体的制备147

二、插入物的制备151

实验一 待分析DNA片段具有与M13克隆位点相匹配的酶切位点时的插入物制备151

实验二 待分析DＮＡ片段末端与Ｍ１３克隆位点不相匹配时的插入物制备151

三、插入物与载体的连接及重组体的转化153

四、序列分析用单链M13 DNA的制备155

第一节 载体一宿主系统158

一、载体158

第三章原核细胞的基因克隆158

二、宿主164

第二节 大肠杆菌的基因克隆165

一、质粒DNA的提取165

二、基因克隆166

实验一 利用限制性内切酶产生的粘性末端或平滑末端进行克隆166

实验二 用碱性磷酸酶使质粒载体的再环化达到最低限度169

实验三 同聚物加尾172

实验四 用合成linker进行克隆177

三、转化180

四、cDNA文库的建立182

第三节 枯草杆菌的基因克隆187

一、DNA的提取189

实验一 质粒DNA的提取189

实验二 枯草杆菌染色体DNA的制备190

二、利用质粒进行基因克隆192

三、转化193

实验一 感受态细胞转化193

实验二 原生质体转化法194

第四节 绿脓杆菌的基因克隆195

一、质粒DNA的提取198

实验一 利用氯化铯-溴化乙锭超速离心法制备中等大小的质粒DNA198

实验二 质粒DNA的快速检出法200

二、假单胞菌的转化202

第五节 放线菌的基因克隆204

一、转化206

二、菌落杂交208

第四章酵母菌的基因克隆210

第一节 DNA的分离方法211

实验一 酵母总DNA的抽提211

实验二 酿酒酵母共价闭合环状DNA的分离212

实验三 自大肠杆菌中提取扩增的质粒DNA214

一、克隆载体216

第二节 酵母菌的克隆216

二、载体构建218

三、自我复制载体221

四、2μm DNA载体221

五、着丝粒载体223

六、表达载体224

七、LEU2基因的克隆225

第三节 转化226

一、宿主菌株226

二、原生质体的使用227

三、碱性阳离子的使用230

第四节 克隆的选择231

第五节 基因融合法233

实验一 体内半乳糖激酶试验236

实验二 体外半乳糖激酶试验236

第五章利用体外诱变制备突变株239

第一节 缺失突变株240

实验一 获得单纯缺失突变株的方法241

实验二 生成微细缺失突变株的方法245

第二节 插入突变株250

实验一 部位特异性插入法251

实验二 随机插入法254

第三节 用合成寡脱氧核糖核苷导入点突变258

一、DNA模板的制备261

实验一 单链闭环DNA模板的制备261

实验二 由双链重组质粒制备环状单链DNA模板264

二、导入突变用寡脱氧核糖核苷特异性的确定265

实验一 利用脉冲追踪起动方法加以确定265

实验二 利用链终端法确定DNA碱基序列268

三、杂环双链DNA的体外合成272

四、杂环双链DNA的浓缩274

实验一 通过S1核酸酶消化进行浓缩274

实验二 利用碱-蔗糖密度梯度离心法进行浓缩275

五、转染与转化276

实验一 转染277

实验二 转化279

六、突变株的筛选281

实验一 利用链终端法确定碱基序列281

实验二 限制性内切酶酶切位点的筛选282

实验三 通过杂交进行筛选284

实验四 生物学方法筛选286

附录287

主要参考文献296