《DNA克隆技术》求取 ⇩

第一章　DNA克隆概论1

1.1　DNA克隆的基本原理2

1.2．基因克隆方式6

1.3．克隆基因的功能研究9

第二章　DNA克隆中的工具酶11

2.1．限制性核酸内切酶11

2.1.1．限制性核酸内切酶的类型和作用特点11

2.1.2．常用的限制性核酸内切酶的反应条件和影响因素19

2.2．DNA聚合酶21

2.2.1．E.coli DNA聚合酶121

2.2.2．T.DNA聚合酶23

2.3．连接酶24

2.3.1．T.DNA连接酶24

2.3.2．T.RNA连接酶25

2.4．用于DNA克隆的其它酶类26

2.4.1．核酸外切酶26

2.4.2．核酸酶S126

2.4.3．逆转录酶28

第三章　DNA克隆载体30

3.1．质粒载体30

3.1.1．常用的质粒载体31

3.1.2．质粒DNA的提取和纯化38

3.2．λ噬菌体载体41

3.2.1．常见的λ噬菌体载体42

3.2.2．λ噬菌体的生长、纯化和DNA提取48

3.3．柯斯载体（cosmid）52

3.3.1．柯斯载体的特性52

3.3.2．常用的柯斯载体52

3.4．单链载体58

3.4.1．常用的单链载体58

3.4.2．单链载体DNA的制备和纯化60

3.5．广谱宿主载体65

3.5.1．广谱宿主范围的质粒载体66

3.5.2．广谱宿主范围的柯斯载体66

3.5.3．广谱宿主范围的可调表达载体68

3.5.4．广谱宿主范围的低拷贝数载体73

3.6．病毒载体74

3.6.1．动物病毒载体74

3.6.2．植物病毒载体87

3.6.3．昆虫病毒载体89

3.7．特殊载体93

3.7.1．YAC克隆载体93

3.7.2．Ti质粒——转移植物基因的质粒载体93

第四章　载体在DNA克隆中的运用98

4.1．λ噬菌体载体在构建基因文库中的运用98

4.1.1．完整的基因文库98

4.1.2．λ置换载体的克隆原理98

4.1.3．供体DNA和载体DNA的分离101

4.1.4．重组和包装107

4.1.5．用有限的供体DNA构建文库109

4.1.6．文库的扩增和筛选111

4.1.7．置换载体的选择114

4.1.8．宿主细菌的选择115

4.2．具体操作方法118

4.2.1．培养基和缓冲液118

4.2.2．检测酶活性120

4.2.3．高分子量的真核细胞核DNA的分离121

4.2.4．Sau3A部分降解123

4.2.5．NaCl密度梯度分级分离124

4.2.6．载体DNA的检测和切割125

4.2.7．最适连接条件的确定127

4.2.8．杂交筛选128

4.3．柯斯克隆130

4.3.1．柯斯克隆的特点130

4.3.2．柯斯克隆的一般程序131

4.4．质粒载体在亚克隆中的运用134

4.4.1．pBR322作亚克隆的一般程序136

4.4.2．质粒与插入片段的连接136

4.4.3．转化细菌138

4.4.4．菌落杂交139

第五章　cDNA克隆141

5.1．用于cDNA克隆的mRNA141

5.2．不同丰度mRNA的cDNA克隆142

5.2.1．高丰度mRNA的cDNA克隆142

5.2.2．低丰度mRNA的cDNA克隆143

5.3．cDNA的合成143

5.3.1．cDNA第一链的合成143

5.3.2．cDNA第二链的合成145

5.3.3．双链cDNA的制备方法146

5.4．载体的选择及载体DNA的制备155

5.4.1．λgt10克隆载体的制备156

5.4.2．λgt11克隆载体的制备157

5.5．cDNA与载体分子的连接158

5.5.1．同源多聚尾连接法158

5.5.2．人工接头或套头（adapters）连接法159

5.5.3．连接方法163

第六章　重组DNA导入受体细胞166

6.1．重组DNA导入细菌细胞——E.coli转化技术166

6.1.1．菌株的选择167

6.1.2．用于转化的E.coli菌株的保存168

6.1.3．转化方式169

6.1.4．转化的估价186

6.1.5．转化有关的基本方法187

6.1.6．特殊应用188

6.2．重组DNA导入酵母细胞193

6.2.1．原生质体转化194

6.2.2．完整细胞的转化195

6.3．克隆基因导入动物细胞196

6.3.1．原生质体融合197

6.3.2．多聚阳离子介导转染199

6.3.3．磷酸钙DNA共沉淀转染199

6.3.4．DEAE葡聚糖介导转染203

6.3.5．电穿孔204

6.4．植物细胞的转化206

6.4.1　根瘤脓肝菌共培养法转化原生质体208

6.4.2　Ti质粒直接转化原生质体210

第七章　重组子的筛选与鉴定213

7.1．区分转化子与非转化子的筛选方法213

7.2．区分重组子与非重组子的筛选方法214

7.2.1．抗药性标记插入失活法214

7.2.2．CI基因插入失活法215

7.2.3．β-半乳糖苷酶显色反应筛选法215

7.2.4．凝胶电泳检测法216

7.3．鉴定含目的DNA片段的重组子的筛选方法219

7.3.1．同源重组筛选法219

7.3.2．核酸杂交法220

7.4．鉴定目的基因产物重组子的方法231

7.4.1．利用遗传缺陷型寄主细菌筛选目的基因232

7.4.2．免疫沉淀法检测重组子232

7.4.3．免疫筛选λ噬菌体载体构建的表达文库233

7.4.4．细菌菌落的免疫筛选236

7.4.5．利用寡聚核苷酸筛选λ噬菌体表达载体构建的cDNA文库237

第八章　克隆DNA的定位诱变243

8.1．缺失突变243

8.1.1．简单切离缺失244

8.1.2．核酸酶Bal31消化产生缺失突变244

8.1.3．胰DNaseI切割双链闭环DNA产生缺失突变248

8.1.4．利用核酸外切酶Ⅲ构建细微缺失突变250

8.2．插入突变253

8.2.1．简单的特定位点插入254

8.2.2．利用胰DNaseI进行随机插入255

8.3．寡聚核苷酸介导定位诱变256

8.3.1．缺口双链法258

8.3.2．双引物法267

8.3.3．掺“U”法274

第九章　多聚酶链式反应体外扩增DNA278

9.1．PCR的基本原理278

9.2．PCR的基本程序280

9.3．PCR在分子克隆中的应用282

9.3.1．扩增特定的克隆双链DNA序列282

9.3.2．选择性扩增特定cDNA片段制备探针283

9.3.3．利用微量mRNA建立cDNA文库285

9.3.4．扩增DNA用于序列分析285

9.3.5．定位诱变与突变分析289

9.3.6．RNA PCR操作程序290

9.3.7．扩增DNA序列分析程序290

第十章 克隆基因在原核细胞中的表达294

10.1．克隆基因表达的基本概念294

10.1.1．基因工程的主要内容294

10.1.2．克隆真核基因表达的条件、困难与措施294

10.1.3．克隆基因的表达系统296

10.2．融合蛋白的表达297

10.2.1．表达融合蛋白的必要条件297

10.2.2．Lac Z融合基因的表达298

10.3．完整天然蛋白的表达301

10.3.1．原核基因的表达301

10.3.2．真核基因的表达304

10.4．克隆基因表达的检测与增强310

10.4.1．克隆基因表达量的检测方法310

10.4.2．蛋白质检测方法312

10.4.3．增强克隆基因表达的方法314

10.5．克隆基因在E.coli中表达的实例318

10.5.1．生长激素释放抑制因子的表达318

10.5.2．EB病毒早期抗原融合蛋白的表达318

10.5.3．HBcAg基因的表达319

第十一章　克隆基因在真核细胞中的表达323

11.1．克隆基因在酵母细胞中的表达323

11.1.1．在酵母细胞中转化与表达的质粒载体323

11.1.2．外源DNA的导入、整合与复制324

11.1.3．外源DNA在酵母细胞中的表达326

11.2．克隆基因在哺乳动物细胞中的转化与表达330

11.2.1．克隆基因对哺乳动物细胞的转化330

11.2.2．转化细胞的筛选标志331

11.2.3．扩增系统337

11.2.4．蛋白质的表达338

11.3．克隆基因在昆虫细胞中的表达344

11.3.1．杆状病毒与昆虫细胞的某些特点344

11.3.2．外源基因在昆虫细胞中表达的主要步骤345

11.3.3．影响昆虫细胞表达外源基因的主要因素346

11.3.4．克隆基因在昆虫细胞中表达的实例349

参考文献352