《表1 引物序列：miR-199-3p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响》

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《miR-199-3p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响》

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收集转染与未转染U-2 OS、hFOB细胞、患者组织，采用TRIzol提取试剂进行总RNA的提取，将提取后的总RNA使用紫外分光光度仪与琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、浓度与完整性。miR-199a-3p检测方法如下:使用PCR试剂盒中自带的逆转录试剂盒对与总RNA进行反转录，操作步骤严格按照试剂盒说明进行操作。随后进行PCR扩增实验，PCR反应体系:cDNA 1μl，上下游引物各0.4μl，2×TransTaqTip Green qPCR SuperMix10μl，Passive Reference Dye（×50）0.4μl，最后加入ddH2O补全至20μl。PCR反应条件:94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共进行40循环。每个样品设3个重复孔，实验共进行3次。本次研究使用U6作为内参，使用2-ΔΔCt对本次数据进行分析。m TOR检测方案如下，使用PCR试剂盒中自带的逆转录试剂盒进行反转录操作，步骤严格按照试剂盒说明进行操作。随后进行PCR扩增实验，PCR反应体系:cDNA 1μl，上下游引物各0.4μl，2×TransScriptTip Green qPCR SuperMix 10μl，Passive Reference Dye（50×）0.4μl，最后加入Nuclease-free Water补全至20μl，PCR反应条件:94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共进行40循环。每个样品设3个重复孔，实验共进行3次。本次研究使用GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt对本次数据进行分析。使用美国ABI公司7500PCR仪进行检测。引物序列见表1。