《表1 扩增IL-27EBI3和IL-12p35编码序列的引物》

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《人IL-35单克隆抗体制备及其在定量ELISA检测方法中的应用》

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根据Gen Bank中IL-27EBI3已知序列（Gen Bank Accession No.NM＿005755.2）和IL-12p35已知序列（GenBank Accession No.NM＿000882.3）设计扩增IL-27EBI3和IL-12p35编码基因的引物，引物如表1所示。在PCR反应管中加入HUEVC细胞总RNA 5μL，70℃作用5 min后冷却至0℃，依次加入超纯水9.5μL，5×AMV缓冲液5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.5μL，RNasin 1μL和AMV反转录酶1μL，于50℃反转录60 min，95℃5 min灭活反转录酶。在PCR反应管中加入超纯水34μL，10×PCR缓冲液5μL，反转录产物2μL，dNTPs（10 mmol/L）1μL，上游引物和下游引物各1μL，25 mmol/L MgCl2 25μL，Pfu DNA聚合酶1μL，其中P1、P2扩增IL-27EBI3编码基因，P3、P4扩增IL-12p35编码基因。PCR反应条件为:95℃5 min；然后95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃10 min，冷却至4℃保存。对扩增产物及质粒pTS分别进行XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切，将IL-27EBI3和IL-12p35编码基因分别连入载体pTS中，形成IL-27EBI3表达载体pTES和IL-12p35的表达载体pTPS，转化大肠杆菌Top10，进行载体的扩增，提取质粒进行序列测定，确保基因的连接和序列正确，表达载体分别转化大肠杆菌BL21 star（DE3），形成稳定表达IL-27EBI3和IL-12p35的基因工程重组菌株。