《表2 单克隆抗体的抗原特异性鉴定》

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《人IL-35单克隆抗体制备及其在定量ELISA检测方法中的应用》

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用纯化制备的重组IL-27EBI3和IL-12p35分别免疫5只雌性Balb/C小鼠，选择其中3只血清抗体效价较高的小鼠的脾细胞与SP2/0进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。以重组IL-27EBI3和IL-12p35分别作为抗原，同时以空表达载体转化的大肠杆菌（BL21 star(DE3）)裂解液作为阴性对照，用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，经多轮检测和有限稀释法克隆3次后，获得了3个稳定分泌抗IL-27EBI3单克隆抗体的细胞株3B11、3D07、3E10和3个稳定分泌抗IL-12p35单克隆抗体的细胞株3A10、3B09、3B12。在后续研究中，各单克隆抗体以其来源的细胞株命名。以重组IL-27EBI3和IL-12p35作为阳性对照，以空表达载体转化的大肠杆菌（BL21 star(DE3）)裂解液作为阴性对照，Western blotting对上述细胞株分泌抗体的抗原特异性进行了鉴定（表2）。结果表明，单抗3B11、3D07、3E10都能与重组IL-27EBI3发生免疫反应，3B11和3D07同样能与含有EBI3亚基的IL-27和IL-35发生免疫反应，与不含EBI3亚基的IL-12和IL-23不发生免疫反应，同时也不具备与IL-6和IL-10的免疫反应性，而3E10与IL-12和IL-23都具有交叉反应。单抗3A10、3B09、3B12都能与重组IL-12p35发生免疫反应，3A10和3B12同样能与含有p35亚基的IL-12和IL-35发生免疫反应，与不含p35亚基的IL-12家族成员IL-23和IL-27不发生免疫反应，同时也不具备与IL-6和IL-10的免疫反应性，而3B09与IL-23具有交叉反应。对抗原特异性较好的3B11、3D07、3A10和3B12细胞株分泌抗体的效价进行了测定（图3A），发现单抗3B11效价高于3D07，3A10效价高于3B12，因而选取单抗3B11和3A10进行后续研究。用Protein A柱对单抗3B11和3A10进行纯化制备，通过一步亲和层析纯化，纯度可达到95%以上（图3B）。对纯化样品进行超滤浓缩，蛋白浓度可达到2 mg/mL。依照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒的说明，以HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA的单抗为二抗，用夹心ELISA对单抗3A10和3B11进行了亚类鉴定，发现两株单抗均为IgG1（图4）。