《表2 磺胺类耐药基因扩增引物》

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《异育银鲫源嗜水气单胞菌对磺胺类耐药性分析》

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按照天根试剂盒操作说明分别提取嗜水气单胞菌基因组DNA和质粒DNA，经RNase A酶去除DNA制备过程中的RNA，-20℃保存备用。磺胺类药物耐药基因Sul1、Sul2和Sul3引物参照文献[11]的报道（表2）。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。分别以嗜水气单胞菌基因组DNA和质粒DNA为模板，常规PCR扩增磺胺类耐药基因Sul1、Sul2和Sul3。扩增采用50μL体系，包括25μL Premix Taq酶，上、下游引物各2μL，DEPC处理水19μL，模板2μL。3个基因的扩增程序一致:94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，72℃终延伸7min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对出现与目的片段大小相符的条带进行切胶回收，回收产物按操作说明与pMDTM19载体连接后导入工程菌DH5α中构建重组质粒，提取重组质粒DNA用相应基因引物进行扩增，扩增阳性的质粒外送测序。序列结果利用DNAMAN软件进行序列间相似性分析，再通过美国国立生物技术信息中心基因库中Blast比对，并利用Clustal X 3.0和Mega 6.0软件构建耐药基因系统发育树。