《表1 抗生素耐药基因扩增的引物序列与产物长度》

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《2019年海口市人工泳池水质及耐药基因流行特征》

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挑取单克隆细菌于5 m L TSB肉汤中培养，再用水煮法提取细菌DNA，普通PCR扩增时用水煮法进行，测序时用试剂盒提取质粒。选择对革兰氏阴性菌中出现频率高及对人体耐药风险大的共8种基因进行检测。于美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）查找引物序列，由上海生物工程股份有限公司合成。耐药基因种类如表1。扩增条件：共25μL；反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，10μmol·L-1正向、反向引物各0.5μL，无菌水10.5μL，DNA模板1μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性15 s，退火温度56℃30 s，72℃延伸1 min，30个循环；分别将上述扩增得到的产物于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，其中U=120 V，I=100 m A，t=40 min，最后凝胶成像系统观察条带。PCR扩增阳性的菌株经上海生物工程公司测序，测序结果上传至NCBI进行比对，将电泳条带阳性或测序结果准确的菌株均计入基因阳性菌株。