《表1 重组载体构建引物设计》

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《神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成》

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目的基因neuA（GenBank:U60146.1），cst（GenBank:AF130466.2），gne（GenBank:905422），cgtA（GenBank:AF401528.1），cgtB (GenBank:AF130984.1）均由本实验室保存。重组载体采用重叠延伸PCR (Prolonged Overlap Extension cloning）的方法构建而成[18]。以重组质粒pUC18-neuA-cst的构建为例说明POEPCR的具体方法。在引物设计时，基因片段与载体之间，串联基因之间均保留25 bp左右的同源臂，分别使用特异性引物IF1-neuA/IR1-neuA扩增第一个插入片段neuA基因，引物IF2-cst/IR2-cst扩增第二个插入片段cst基因，引物VF1-pUC18/VR1-pUC18进行反向PCR扩增来制备线性化载体。扩增获得的基因片段和线性载体进行胶回收后，以基因片段和线性化载体互为模板和引物进行下一轮的PCR扩增。PCR产物直接转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，在含氨苄抗性的平板上挑取单克隆进行培养，培养的菌液提取质粒并测序验证，获得重组质粒pUC18-neuA-cst。另两个重组质粒的构建方法同上，gne和cgtA基因串联克隆至pBBR1MSC3载体，获得重组质粒pBBR1MCS3-gne-cgtA，cgtB基因克隆至pACYC184载体，获得重组质粒pACYC184-cgtB。引物设计见表1。