《表1 用于检测的引物和PCR反应程序》

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《无籽沙糖桔WUBE1基因的功能验证》

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烟草遗传转化和分子检测通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法[25]将pBI121-WUBE1转化烟草，获得抗性植株。用改良CTAB法提取抗性植株叶片的总DNA[25]，以pBI121-UBE1质粒为阳性对照，野生型植株叶片的基因组DNA为阴性对照，进行多重引物（NPT II、35S、WUBE1和Chv A）的PCR检测（表1）。对PCR检测为阳性的植株基因组DNA用Eco R I内切酶于37℃水浴中酶切过夜，用0.7%琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上固定。用PCR-DIG探针标记试剂盒制备地高辛标记的NPT II探针片段，然后进行杂交、显影和定影[26]。用华越洋生物超快型植物RNA提取试剂盒提取转WUBE1基因单拷贝植株叶片总RNA。用M-MLV逆转录酶进行第一链c DNA的合成，具体步骤参照试剂说明书。以烟草β-actin为内参基因（表1），用实时荧光定量PCR（q PCR）检测外源基因在不同转基因植株中的表达情况[27]。