《表1 靶点序列及shRNA序列》

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《腺相关病毒介导shRNA敲减小鼠海马兴奋性氨基酸转运体3动物模型的构建》

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从GenBank数据库获取SLC1A1m RNA（编号:NM＿009199.1）序列并筛选出4处靶点，使用Designer 3.0（Genepharma）软件设计4条效应shRNA模板DNA，命名为mSLC1A1-1、mSLC1A1-2、mSLC1A1-3、mSLC1A1-4；同时设计1条阴性对照shRNA模板，命名为NC（表1）。按设计序列合成OligoDNA，在退火液中按梯度退火后与经LguⅠ（SapⅠ）酶切线性化的AAV-GP-1（pAAV-U6-EGFP）载体质粒连接，转化DH5α大肠埃希菌挑取阳性克隆，经质粒抽提得5种重组质粒，命名为pAAV-GP-shRNA-SLC1A1-1-EGFP、pAAV-GP-shRNA-SLC1A1-2-EGFP、pAAV-GP-shRNA-SLC1A1-3-EGFP、pAAV-GP-shRNA-SLC1A1-4-EGFP、pAAV-GP-shRNA-NC-EGFP，送苏州金唯智科技有限公司测序鉴定。将测序正确的质粒与pHelper包装质粒、pAAV-DJ辅助质粒共转染AAV293细胞6 h，更换为完全培养基培养72 h，收集细胞和上清液，-80℃/37℃冻融3次，2 000 r/min离心5 min，取上清，密度梯度离心纯化后可得到5种rAAV，命名为rAAV-shRNA-SLC1A1-1-EGFP、rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP、rAAV-shRNA-SLC1A1-3-EGFP、rAAV-shRNA-SLC1A1-4-EGFP、rAAV-shRNA-NC-EGFP。将病毒液有限梯度稀释病毒液侵染293T细胞，荧光计数法测定病毒液滴度[9]。