《表2 产生amiRNA前体的标准反应体系》

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《马铃薯海藻糖酶基因人工miRNA载体的构建》

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以质粒载体pRS300（图6）为模板，用引物ⅠStTRE-s、ⅡStTRE-a、ⅢStTRE*s、ⅣStTRE*a、A和B的不同组合（表2），经过巢式PCR扩增，将模板质粒（pRS300）中拟南芥miR319a前体结构中原有的成熟序列（20 bp）替换成StTRE基因amiRNA的成熟序列（21 bp）。首先，按照产生amiRNA前体的标准反应体系，在第一轮的PCR扩增中分别获得包含5'臂的a片段、中心环的b片段和3'臂c片段（图7），再以这a、b和c片段切胶回收的混合样做为模板，用通用引物A和B进行巢式PCR反应的第二轮扩增，获得701 bp大小的d片段（图7）。将d片段与克隆载体pMD誖18-T连接，构建重组载体。然后将重组载体转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆送往测序公司进行测序检测，测序正确的质粒命名为pMD18-amiR-StTRE。