《表3 用于微生物定量的引物序列信息》

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《过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响》

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本课题组构建了总细菌及功能微生物的质粒，对总细菌、纤维降解菌[产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）、黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）]、淀粉降解菌[反刍兽新月形单胞菌（Selenomonas ruminantium）]、分解葡萄糖的细菌[普雷沃氏菌属（Prevotella）、栖瘤胃普雷沃氏菌（Prevotella ruminicola）]及免疫相关细菌[梭菌属ⅪⅤ子集（Clostridial clusterⅪⅤ）、乳杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）]进行绝对定量。按照焦金真等[26]的方法，运用已验证的相应的微生物的特异性引物（表3），分别将含有特定微生物组16S rRNA基因插入物的质粒DNA连续稀释10倍，构建标准曲线。标准曲线的斜率在-0.319 7～-0.295 9，并且相关系数（R2）均大于0.99，符合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的标准曲线要求。根据MIQE指南中微生物引物的扩增效率=10-slope-1（slope为标准曲线的斜率）[27]，可以得到本试验中引物的扩增效率均处于95%～105%，说明引物的扩增效率较好。同时，每对引物均设置相应的NTC和NRC。然后按照拷贝数公式[拷贝数=（标准曲线Ct值得到的拷贝数×每个样品基因组DNA的浓度×提取DNA时最后溶解DNA的ddH2O的体积）/（用于qRT-PCR的DNA量×提取DNA时所称量的食糜的重量）]计算出每克食糜中总细菌及功能微生物的拷贝数，之后转换为每克食糜中总细菌或功能微生物拷贝数的对数值[lg（拷贝数/g）]进行统计分析。