《表1 PCR引物和定点突变引物列表》

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《米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造》

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注:下划线为点突变位点。

coRML定点突变基因通过二步法全质粒定点突变方法完成[12]，coRML定点突变基因RM-Q、RM-H和RM-S对应的定点突变引物分别为RMQF1和RMQR1、RMHF1和RMHR1以及RMSF1和RMSR1，引物序列见表1。coRML定点突变基因以质粒pP-coRML作为模版。通过二步法PCR反应扩增，电泳检测PCR反应结果。加入Dpn I酶和反应缓冲液对PCR反应产物模板DNA做消化处理，37℃处理2 h。通过电泳切胶回收特异性扩增片段（10 kb处条带），回收产物预冷后加入大肠杆菌感受态细胞，热激转化、复苏后涂板于LBA平板，37℃过夜培养，挑2～3个单菌落LB液体培养基中培养过夜后提质粒，通过对质粒测序，确定符合预期的突变体克隆。各表达载体的酵母菌株简称为GS-对应基因名，如pP-RM-Q转化菌株命名为GS-RM-Q等。