《表3 梯度引物浓度扩增CT值及扩增效率计算结果》

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《珠子参实时荧光定量PCR体系的建立与优化》

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注:与3.3.1中的阴性对照相同，其体系为:模板为120 ng/μL、引物浓度为10μmol/L，其作用就是证明H2O等物质没有被DNA污染。k=En/E5，其中En表示第n个实验组的扩增效率，E5表示第5个实验组的扩增效率。

最优模板浓度确定后，使用模板浓度为120ng/μL，采用超微量紫外分光光度计测量β-actinF、β-actin-R引物浓度为10μmol/L，依次稀释为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.625μmol/L 5个浓度梯度，设置一个阴性对照，三个重复组，进行实时荧光定量PCR反应，对引物浓度进行优化检测，其扩增结果如图4所示。计算其扩增效率时因为模板浓度不变，即模板初始浓度X0都相同，所以E’/E1=（X1×2CT）/（X’×2CT’）=5（n-1）×2-△CT=2-△CT，结合计算和浓度梯度的扩增曲线，当引物浓度为10μmol/L时，得到的扩增曲线最好，模板扩增效率最高，因此引物最优浓度为10μmol/L，如表3所示。