《表1 棋盘法优化种毒条件的分组》

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《流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化》

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取出冻存的MDCK细胞，立即放置37～38℃温水浴中解冻，用10 m L完全培养基（含5%胎牛血清和4 nmol/L L-Glutamine的VP-SFM培养基）培养至T25细胞培养瓶，于37℃，5%CO2恒温细胞培养箱培养6～8 h；更换新鲜完全培养基，继续培养。稳定培养3代后，以3×106个/瓶接种至T75细胞培养瓶，加入17 m L完全培养基，于37℃，5%CO2恒温细胞培养箱培养24～30 h；用PBS洗涤2次，分别按MOI=0.1、0.01、0.001和0.000 1（用不含TPCK胰酶的病毒维持液将病毒进行稀释）接种H1N1(IVR-180）、H3N2(IVR-186）、BV(NYMC BX-69A）、BY(B/Phuket/3073/2013）疫苗株，加入17 m L病毒维持液（含终浓度分别为0.5、1、1.5、2、3和4μg/m L TPCK胰酶、1×青链霉素及4 nmol/L L-Glutamine的无血清VP-SFM培养基），其中H1N1(IVR-180）疫苗株病毒维持液的TPCK胰酶终浓度分别为0.5、1、1.5、2μg/m L，其他3株病毒维持液的TPCK胰酶终浓度分别为1、2、3和4μg/m L。棋盘法优化种毒条件分组见表1。每24 h取细胞培养上清液进行血凝滴度检测，至血凝滴度开始下降或细胞完全脱落；选取各疫苗株以血凝滴度评判为最适种毒条件（组间数据相同时，选取较低终浓度TPCK胰酶或较低MOI组为最佳）的组别进行病毒滴度检测，综合两项指标确定最佳收毒时间。