《表1 引物序列：氟苯尼考对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)早期发育的影响》

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《氟苯尼考对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)早期发育的影响》

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取氟苯尼考暴露24 h后的牡蛎D型幼虫置于液氮中冷冻，于–80℃保存。使用RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取牡蛎幼虫总RNA，利用超微量核酸蛋白检测仪（IN0311，Monad）检查RNA浓度（260 nm）和纯度（260/280 nm）。使用Evo M-MLV反转录试剂盒（AG11705，湖南艾科瑞生物工程有限公司）将RNA反转录为c DNA模板。使用Trans Start TOP Green q PCR Super Mix试剂盒（Transgen Biotech）进行荧光定量PCR（Lightcycle 96，Roche）。选择与牡蛎幼虫生长发育相关的基因，ILPR、Cg-Tyr、CYP356A1、Ferritin、HSP70、Cg-Tal和Caspase7，根据太平洋牡蛎幼虫基因组设计引物，序列如表1所示[28]。q PCR反应参数设置为:94℃预变性30 s，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环，循环完成后72℃延伸5 min。各引物序列及优化的退火温度如表1所示。选择核糖体蛋白L7（RL7）为管家基因用于标准化其他目标基因的表达水平，该基因在各处理组间未显示差异性，q RT-PCR数据采用2–ΔΔCt法进行分析。每个样品测量进行三次检测。