《表3 qRT-PCR引物序列》

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《复合益生菌固态发酵豆粕对断奶仔猪生长性能、肠道形态及肠道菌群的影响》

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样品在液氮下充分研磨为粉末，用总RNA提取试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，美国）提取组织样本总RNA，溶解于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，-80℃存储。用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估RNA的浓度和纯度，所有样品A260/A280的值为1.8～2.0，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取等量（1μg）总RNA，利用反转录试剂盒（TaKaRa，日本）反转录总RNA样品得第1链cDNA，反转录产物在-20℃保存备用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR）反应（Bio-Rad CFX System）为10μL体系：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad美国）5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA模板2.0μL(10倍稀释），ddH2O 2.0μL，每个样品3个重复孔。扩增程序设定：95.0℃预变性30 s，95.0℃变性15 s，退火30 s，72.0℃延伸30 s，40个循环；之后进行熔解曲线分析。使用的引物均根据GenBank中猪的基因序列，取保守区域设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表3。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达量。