《表1 qRT-PCR引物序列5'-3'》

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《DHEA对小鼠超排卵和卵母细胞质量的影响》

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检测卵丘细胞中基因转录水平:通过1.2.1中的方法超排卵，经过透明质酸酶消化分离卵丘细胞和卵母细胞，收集卵丘细胞，按单细胞RNA提取试剂盒说明书步骤提取卵丘细胞总RNA，采用TAKARA反转录试剂盒进行反转录，应用Roche LightCycler96进行Real-time PCR（SYBR Green荧光染料购自TAKARA公司）。表1为qRT-PCR引物序列。目的基因和内参基因β-actin分别在同一批次的96孔板上、不同的PCR管中扩增。PCR总反应体系为20μL，上、下游引物各1μL，1∶100稀释后的cDNA模版1μL，ddH2O 7μL，SYBR 10μL。95℃预变性30 s后，再进行如下40个循环:95℃5 s，60℃30 s。每一份标本进行复管检测。得到各管标本的扩增曲线和目的序列的Ct值，以及检测该管标本内参基因β-actin的Ct值，计算各管标本的待测序列的ΔΔCt值[ΔΔCt=（待测目的基因Ct值-待测组内基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）]，则该基因的mRNA相对表达为2—ΔΔCt。