《表3 芳香环双加氧酶的蛋白质工程改造》

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《微生物Rieske型芳香环双加氧酶研究进展》

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蛋白质工程已经被用来提高Rieske型芳香环双加氧酶的催化速率、底物特异性和立体选择性。依据目前对酶结构和功能的认识，设计改造双加氧酶是优化和提升微生物生物催化能力的有效手段。基于活性位点的定点诱变和基因重组技术可以获得更加高效降解芳香族化合物的双加氧酶突变体（表3）。Barriault等[30]已经证明联苯双加氧酶α亚基中氨基酸与底物识别有关，定点诱变α亚基中氨基酸，发现部分氨基酸的取代能够改变酶对底物的特异性或提高酶的催化效率。这些氨基酸的位置靠近单核铁活性中心，可能在酶的催化活性中起一定的作用。对Burkholderia 2，4-二硝基甲苯双加氧酶（DDO）α亚基的I204位点饱和突变，突变体DDO提高了对2，4-和2，6-对二硝基甲苯的氧化能力[43]。Bernath-Levin等[44]通过多种蛋白质工程技术得到硝基苯双加氧酶突变体，其催化能力是野生型的3倍。突变体主要通过增大底物结合口袋空间和改变底物结合模式的方式提高酶的活性。对Pseudomonas sp.NCIB 9816-4萘双加氧酶的诱变研究揭示，活性位点的几何形状变化与酶的结构-功能存在关系，在F202，A206，V260，H295，F352和L307位点引入单点突变会导致酶的底物特异性、区域选择性和立体选择性发生剧烈变化，但同时保留对天然底物萘的活性[13]。同样地，通过改变一个活性位点氨基酸侧链的大小，能够改变酶的区域选择性和立体选择性[12]。此外，利用基因重组技术可以将一个双加氧酶α亚基碳端的部分片断替换到另一个双加氧酶α亚基上，获得的新的活性双加氧酶同时具有两个亲本的催化特性[45]。DNA改组技术发现萘双加氧酶的225和407位点残基，对酶的底物特异性产生影响，并可以提高酶对二硝基甲苯的活性[46]，另外对联苯双加氧酶DNA的改组实验获得了高效降解多氯联苯及其同系物的基因[47]。