《表1 PCR扩增所用引物及预期目的片段长度》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《甘薯病毒G CH株系和CH2株系中国分离物基因组全序列克隆及结构特征分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

取约0.1 g甘薯病样叶片，在液氮中迅速研磨成粉末，按照Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取甘薯病样叶片总RNA。参照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增SPVG CH株系和CH2株系基因组的不同片段。50μL PCR反应体系：cDNA 3μL、LA Taq DNA聚合酶25μL、ddH2O 20μL、10μmol/L上下游引物（表1）各1μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，根据目的条带大小不同，72℃延伸2～4 min，循环35次；72℃最终延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带参照胶回收试剂盒说明书进行纯化。将纯化的目的片段分别与pMD19-T载体进行连接，连接体系：10×T4 DNA连接酶Buffer 1.5μL、T4 DNA连接酶1μL、目的条带回收产物12.5μL，16℃水浴连接4 h以上。将连接产物转化至大肠杆菌TG1感受态细胞。经菌液PCR方法筛选阳性克隆，菌液PCR反应体系：LA Taq DNA聚合酶10μL、ddH2O 8μL、10μmol/L上下游引物（表1）各0.5μL、菌液1μL，扩增方法同对应目的条带PCR反应条件。每个片段选取3～5个筛选到的阳性克隆进行测序，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。同时，利用RACE技术获得了2个分离物基因组的5′和3′末端序列，委托宝生物工程（大连）有限公司完成。利用DNAMAN软件对获得的6段序列分别与CH株系和CH2株系的5′、3′末端序列进行拼接，获得SPVG CH株系和CH2株系中国分离物的基因组全序列，对其基因组全序列进行比对，分析其基因组结构特征，并提交至GenBank获得相应登录号。