《表3 Overlap PCR引物》

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《基于SOS反应及氧化应激反应相关启动子的辐射生物传感器研究》

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EGFP基因和Cda启动子模板来源于实验室保存的质粒，其他三种启动子来源于BL21大肠杆菌基因组（E.coli BL21），将实验室保存的BL21大肠杆菌接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，提取基因组DNA。根据KEGG官网上下载的启动子序列和报告因子基因序列，设计启动子和报告因子基因引物。以上述提取的基因组DNA为模板，PCR特异性扩增RecA、SulA和SoxR启动子片段；实验室保存的含Cda基因序列的p UC57质粒作为模板，PCR特异性扩增Cda启动子序列（引物见表2），以实验室保存的含EGFP质粒为模板，PCR特异性扩增报告基因EGFP片段（引物见表2），通过Overlap PCR扩增获得启动子-报告因子DNA片段，原理如图2所示（引物见表3），按以下步骤进行PCR:94℃变性3min，50℃变性30s，72℃延伸1min，（94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min）括号里循环30次。缓冲液为Promega公司提供的2×Master Mix，将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，使用MarkerⅢ比对序列大小，得到相应目的基因的PCR结果。对PCR扩增产物纯化回收，测量纯化后的DNA浓度，进行二次PCR，即Overlap PCR，二次PCR模板为启动子PCR产物2μl、报告基因产物1μl、启动子上游引物1μl、报告基因下游引物1μl、ddH2O 0.5μl。二次PCR琼脂糖凝胶电泳结果对应条带切胶回收，即得目的基因片段。