《表1 脊尾白虾siRNA干扰引物和荧光定量PCR引物的序列》

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《脊尾白虾甘露糖结合凝集素(MBL)基因在抗镉胁迫中的生物学功能分析》

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通过文献得到Cd2+对脊尾白虾96 h的半致死质量浓度为3.650 mg/L，Cd2+对脊尾白虾的安全质量浓度为0.3650 mg/L（谢嘉等，2017）。配制1 mol/L氯化镉（南京化学试剂有限公司生产）母液，配制4组不同浓度梯度的溶液，浓度分别为0.01、0.0175、0.021和0.0278 mmol/L，并设立对照组。实验过程在养殖箱（50 cm×40 cm×30 cm）内进行，每箱放50尾，整个养殖过程24 h不间断充气。1.2.3 RNA干扰挑选健康活跃的成年脊尾白虾（对照组和实验组均为50尾，每次取3尾脊尾白虾），注射siRNA对MBL进行基因沉默，用于siRNA干扰的引物共4条（干扰部位为本实验室已获得的脊尾白虾MBL基因外显子的350～371 bp）（表1），具体操作方法按照TR-102-T7 RNAi Transcripition Kit（Vazyme，中国）的说明书进行。干扰组每克脊尾白虾注射4μg siRNA，注射部位心脏表皮处，对照组每克脊尾白虾注射4μg生理盐水。注射siRNA和生理盐水的脊尾白虾24 h后（按照RNA干扰试剂盒说明书，注射24 h是干扰效率最高的时间点），再进行镉胁迫（Cd2+浓度为0.021 mmol/L）。在4种胁迫浓度下，低浓度（0.01和0.0175 mmol/L）胁迫下，毒性较小，MBL表达量较少；高浓度（0.0278 mmol/L）胁迫下，脊尾白虾死亡太快，而只有0.021 mmol/L浓度下，脊尾白虾死亡率适中，实验可持续时间久，又可检测到MBL较高的表达量，胁迫养殖方法参照1.2.2。