《表1 用于ABCC8基因突变分析的PCR引物和条件》

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《4例先天性高胰岛素血症患儿ABCC8基因突变分析》

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分析针对ABCC8基因（NM＿000352）的39个外显子及KCNJ11基因（NM＿000525）的一个外显子，采用Primer Premier 3.0设计引物，扩增全部外显子以及与外显子交界的部分内含子区域（表1、表2）。PCR反应体系为50μL:TaKaRa LA Taq premix 25μL，上、下游引物各1μL(10 pmol/μL），基因组DNA 100 ng，加去离子水至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60～62℃退火30 s，72℃延伸1 mim，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR扩增产物送英骏生物公司测序，结果与人类基因组ABCC8基因序列进行比较。通过仔细比对人类遗传疾病突变数据库HGMD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP），确定变异是否为新生突变。采用生物信息学软件PolyPhen 2.0、SIFT和Mutation Taster对新生变异的有害性进行预测，并根据美国医学遗传学与基因组学学会发布的标准和指南(ACMG/AMP）对变异进行分类[10]。