《表1 实验所需的引物：GLN1基因过表达对提高酿酒酵母糠醛耐受性的研究》

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《GLN1基因过表达对提高酿酒酵母糠醛耐受性的研究》

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根据GLN1基因序列设计扩增引物P1和P2，如表1所示，该对引物下划线序列与GLN1基因序列同源，两边各有20 bp与质粒pUC19序列同源的同源臂，将目的基因GLN1与经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后的pUC19质粒按照摩尔比为2∶1的比例混合，再向离心管中加入T5核酸外切酶，30℃反应40 min，于冰上停止反应，待100μL感受态细胞解冻后，向其加入5μL反应液，混匀后置于冰上30 min，然后42℃热冲击60 s，随后放置冰上2 min，加入900μL的LB液体培养基，于37℃，250 r/min的摇床中培养1h，培养结束后取100μL菌液涂布于氨苄抗性平板上，于37℃恒温培养12-16 h，对平板上长出的菌落用验证引物P3、P4进行验证，验证成功后，将质粒命名为“pUC-GLN1”。然后用T4 DNA连接酶将质粒pUC-GLN1与质粒pESC-URA进行连接，先将两质粒用限制性核酸内切酶Bam HⅠ和HindⅢ分别进行双酶切，随后对酶切体系进行切胶回收，按照2∶1的摩尔比加入酶切后的质粒pUC-GLN1与酶切后的质粒pESC-URA，再向离心管中加入T4 DNA连接酶，16℃反应30 min，于冰上停止反应，待100μL感受态细胞解冻后，向其加入5μL反应液，混匀后置于冰上30min，然后42℃热冲击60 s，随后放置冰上2 min，加入900μL的LB液体培养基，于37℃，250 r/min的摇床中培养1 h，培养结束后取100μL菌液涂布于氨苄抗性平板上，于37℃恒温培养12-16 h，对平板上长出的菌落用验证引物P5、P6进行验证，验证成功后，将质粒命名为“pESC-GLN1”。