《表2 scFv各序列的相关特征》

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《抗H3N2亚型犬流感病毒重组犬源化抗体的制备及特性分析》

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注：IgV＿H：免疫球蛋白（Ig）的重链（H）可变域（V)；IgC＿CH1＿IgAEGM：α，ε，γ和μ重链的第一个免疫球蛋白恒定域；L1:IgV＿H上的高变区1；L2:IgV＿H上的高变区2；L3:IgV＿H上的高变区3。NCBI Identities（%）：相应基因序列在NCBI数据库中的最高相似性。

取外周血淋巴细胞提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，PCR扩增VH、VL、Fc片段。结果扩增得到的VH片段约450 bp（图1A)，VL片段长度约330 bp（图1B)，Fc片段约1 000 bp（图1C）。VH、VL片段经测序后与GenBank上已上传的犬抗体重链可变区（AF354264.1）以及轻链可变区（XM532962.3）序列比对，符合犬抗体可变区序列特征。重叠延伸PCR拼接VH与VL基因片段，获得scFv全长片段，大小约为870 bp（图1C），与预期结果相符。参照文献[12]，对获得的11个序列进行分析，其中4个序列不含终止子，且它们之间的核苷酸序列相似性为77.86%。相关特性见表2。综合结构域、同源性以及SWISS‐MODEL软件的比对结果，scFv‐8与数据库中已注释的5yd5.1.A(scFv4B08）的氨基酸序列相似性达到53.01%，且覆盖90%以上，其结果值得信赖[13]，是较为理想的候选抗体序列。将scFv‐8与Fc片段相连，构建pET‐32a‐scFv‐Fc重组表达载体片段，在转化感受态后挑取单菌落，并对重组表达载体pET‐32a‐scFv‐Fc进行PCR和测序鉴定，得到1 866 bp大小条带（图1C），其测序结果与预期结果相符，无碱基突变，并符合GenBank上已上传的犬抗体序列（MG787316.1）特征，表明目的基因插入成功。