《表1 CAFs相关特征标志物Real-time PCR引物》

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《间充质干细胞对乳腺癌MCF-7细胞侵袭力的研究》

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2.研究方法:（1）人胎盘羊膜间充质干细胞（hAMSC）的分离和培养。胎盘组织先用预冷的PBS多次洗涤后，剥离羊膜，用眼科剪剪至1mm直径，转到无菌离心管中，加入a-MEM培养基至15ml，再加入等体积胶原酶（2g/L），37℃，5%CO2培养箱。第2天加入0.05%的胰酶1～2h。后加入胎牛血清终止消化，并收集消化液，加入10倍体积的PBS，经200目滤网过滤，2 500 r/min离心20min，PBS洗涤沉淀两次（每次1 500 r/min，离心10min）。进行细胞计数，计数有核细胞数目以1×106个/ml的浓度接种于MSC培养基中，37℃，5%CO2培养箱中培养。传代培养，取第5代细胞，胰酶消化后PBS清洗，鉴定备用。（2）流式细胞仪检测细胞表面抗原。取传代第5代的人胎盘羊膜来源的间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs），胰蛋白酶消化后PBS清洗，离心收集细胞用含0.5%牛血清白蛋白PBS冰上5min封闭，按106细胞/100μl加入带荧光标记的特异性一抗（CD73、CD90、CD105、CD44、CD34、CD45和HLA-DR）或同型对照抗体，室温避光孵育30 min，PBS清洗后流式细胞仪检测，通过细胞表型鉴定hAMSCs。（3）hAMSCs与乳腺癌细胞系共培养体系的建立。使用的人乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7购自北京协和医学院细胞中心，MCF-7培养无特殊，按常规培养方式培养，培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养。（4）试验分三组:试验组（共培养组）:常规胰酶消化MCF-7细胞后，MSC培养基重悬，按约1×105个/孔密度接种于Transwell 6孔板小室。另常规胰酶消化MSCs后，按约2×105个/孔的密度接种于Transwell 6孔板下室，培养基补齐到2 000μl。37℃，5%CO2培养箱内孵育，隔日换液。对照组1（MCF-7细胞MSC培养基组）:MCF-7细胞采用MSC培养基单独培养，以排除MSC培养基本身对MCF-7细胞培养的影响。对照组2（正常组）:MCF-7细胞常规培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中。（5）实时荧光定量PCR检测:按照RNAsimple Total RNA Kit试剂盒说明书提取试验组细胞总RNA，判断RNA提取质量合格后，按TaKaRa公司说明书配制反应体系，10μl体系将500 ng Total RNA反转录成cDNA。在IQ5实时定量PCR仪上运行real-time PCR。每份样品设置3个复孔，独立试验重复3次。CAFs相关特征标志物相关引物序列设计如表1～2。使用SYBR Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）试剂盒对反转录产物cDNA进行相对定量检测，试验选取20μl体系。