《表1 Real-time PCR引物》

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《miR-20调控人乳牙牙髓干细胞向神经元样细胞的定向分化》

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未经处理的第3代人乳牙牙髓干细胞向神经元细胞诱导分化0，3，6，9，12 d以及上述5组第3代人乳牙牙髓干细胞向神经元细胞诱导分化第12天，根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，利用ND-1000紫外/可见光分光光度计检测RNA的A260/280值，用不含RNA酶的ddH2O调整RNA浓度用于后续实验。采用反转录试剂盒提取样本cDNA，反应条件:70℃10 min，冰浴2 min，42℃60 min，70℃10 min，反转录所得c DNA置于-80℃冰箱保存。以c DNA为模版，采用miScript SYBR Green PCR Kit进行实时荧光定量PCR，PCR引物见表1。按照反应体系配置说明书配置总反应液25μL:2×Quantiect SYBR Green PCR 12.5μL；10×miscript Primer Assay 140/27a/U6 2.5μL；RNase-free water5μL；Template cDNA 2.5μL，每个样本设3个复孔，反应条件:95℃预变性15 min；94℃变性15 s；55℃退火30 s，70℃延伸30 s，40个循环，在7300定量PCR仪上进行检测，miR-20以U6为内参，其他目的基因以GAPDH为内参，采用熔解曲线评价PCR结果的可靠性，反应结束后，通过产物的熔解曲线判定引物的特异性。利用2-??Ct法检测人乳牙牙髓干细胞中相关基因mRNA表达水平。