《表1 Real-Time PCR引物序列》

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《柚皮苷促进牙周韧带干细胞增殖和分化的研究》

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取生长良好的第3代牙周韧带干细胞，以2×105个/mL浓度接种于24孔培养板，每孔接种100μL。24 h后，弃去培养液，依照不同柚皮苷浓度（0 mg/mL、0.14 mg/mL、1.4 mg/mL）进行分组，分为两个实验组和一个对照组，每组设3个复孔。在培养7 d、14 d后，通过Real-Time PCR对各组人牙周韧带干细胞的成骨特异性转录因子（Runx2）、骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的基因表达进行检测。吸净24孔培养板中的培养基，PBS缓冲液清洗3次后，向孔中加入800μL Trizol裂解液，冰上反复吹打支架，使细胞充分裂解，收集裂解液，转至离心管中，加入200μL三氯甲烷后充分振荡15 s，冰上静置3 min。4℃，12000 g离心15 min，取上清液400μL至另一离心管中，加入400μL异丙醇，充分混匀后冰上静置10 min，4℃，12000 g离心10 min。充分上清液后加入1 mL无水己醇洗涤沉淀，4℃，7500 g离心5 min后弃去液体，静置3 min，待乙醇完全挥发后加入20μL DEPC水溶解RNA沉淀，60℃金属浴5 min，用NanoDrop 2000C测定抽提RNA的浓度和纯度。提取1μg RNA进行逆转录，利用逆转录试剂盒合成cDNA，以GAPDH为内参，构建PCR反应体系[20μL、cDNA 1μL、引物各0.5μL（表1）、SYBR Green Master mix 10μL、双蒸水8μL]。将配好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行扩增反应，反应条件为95℃，1 min，紧接40个PCR循环（95℃，15 s；64℃，25 s，收集荧光）。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析，基因表达量以检测基因的初始模板量表示（2-△△Ct）。