《表1 Real-time PCR引物序列》

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《内质网应激诱导的自噬对肝细胞凋亡的影响》

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将各组细胞用PBS洗2次，加入1.0 m L TRIzol裂解液在冰上裂解10 min，收集细胞裂解液提取总RNA。采用核酸蛋白仪检测RNA浓度，并根据A260/A280的比值确定所提RNA的纯度，所有样本的A260/A280比值均在1.8～2.0的范围内，符合实验要求。按照Thermo K1622逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系:5×reaction buffer 4μL，dNTP Mix 2μL，Oligo dT1μL，RNase inhibitor 1μL，transcriptase 1μL，RNA样品为含1μg RNA的体积，RNase-free H2O为11μL减去RNA样品的体积。反应条件为25℃10min、48℃60 min、95℃5 min。逆转录合成的cDNA保存于4℃短期内使用。按照说明书配置实时荧光定量PCR反应体系:2×SYBR Green PCR Master Mix12.5μL，上、下游引物各1μL、cDNA模板2μL，RNase-free H2O 8.5μL，总体积25μL。反应条件为:预变性95℃30 s；95℃5 s、60℃30 s，共40个循环。mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt表示。所用引物序列见表1。