《表1 引物参数：草鱼重组瘦蛋白的制备及其对JAK2-STAT3信号通路的作用研究》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《草鱼重组瘦蛋白的制备及其对JAK2-STAT3信号通路的作用研究》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

注:“^”代表酶切位点。

利用Trizol法提取草鱼脑垂体组织总RNA并利用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（大连宝生物工程有限公司）将其反转录成cD-NA。基于草鱼瘦素基因（GenBank登录号:EU-719623.1）cDNA序列，克隆出草鱼瘦素的开放阅读框（open reading frame，ORF），利用Premier 5.0设计引物Leptin-F/Leptin-R（表1）。以反转录获得的草鱼cDNA为模板，通过PCR扩增得到含有瘦素ORF序列的目的片段。以此序列作为模板，用SignaIP-5.0软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测草鱼leptin蛋白的信号肽序列，根据瘦素基因信号肽序列位点和pGEX4T-1质粒的酶切位点，委托上海铂尚生物技术有限公司设计1对去除信号肽的含Eco RⅠ及XhoⅠ双酶切位点的特异性引物（Leptin Eco RⅠ-F/Leptin XhoⅠ-R）。通过PCR扩增，获得去除信号肽的目的片段。PCR扩增反应体系为50μL:cDNA 1μL、Leptin Eco RⅠ-F1μL、Leptin XhoⅠ-R 1μL、dNTP mix 8μL、10×LATaq Plus DNA聚合酶buffer 5μL、LATaq Plus DNA聚合酶0.5μL、ddH2O 33.5μL。反应条件:94℃4 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃3 min，32个循环，72℃10 min；4℃保存。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。挑选条带位置正确的PCR产物，送往上海铂尚生物技术有限公司测序，将测序结果与已知序列进行比对，如果一致，则说明获得了草鱼瘦素基因的目的片段。