《表1 扩增草鱼TLR信号通路基因的特异性引物序列》

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《多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态》

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采用Beacon Designer 8.0设计草鱼TLR信号通路基因的特异性引物（表1）。以草鱼脾脏cDNA为模板进行目的基因PCR扩增，反应体系25.00μL:cDNA模板1.00μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.00μL，10×PCR Buffer（Mg2+）2.50μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.00μL，r Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL。扩增程序:95℃预变性2 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，进行35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用E.Z.N.A?Gel Extraction Kit（OME-GA公司）进行目的条带回收纯化，然后TA克隆至pMD18-T载体上，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。取100.00μL菌液凃布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基上，37℃培养过夜，挑选3个菌落PCR验证呈阳性的克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。