《表1 影响MPCR扩增与检测效果的主要因素》

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《多重PCR技术研究进展》

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MPCR技术的优势在于它的高效性，通过一次扩增反应即可实现对多种病原体进行检测和鉴别，相较多个单重检测而言成本显著降低。MPCR有着广泛的应用前景，但是仍然存在许多影响MPCR扩增与检测效果的因素（表1），其中扩增效率的一致性是最大的难题，检测重数越多，效率一致性往往越低。针对MPCR扩增效率一致性的问题，传统单管多靶标扩增的方式通过不断优化反应体系中缓冲液、酶、引物、探针等的用量，确保每一重的扩增效率保持一致，然而随着检测重数的增加，形成二聚体甚至多聚体的可能性也大幅上升，轻则导致非特异性扩增的出现，靶标扩增效率下降，检测灵敏度和特异性降低，重则导致非特异性扩增占据主导，靶标扩增失败，造成假阳性和/或假阴性，影响检测准确性。而基于微流控的MPCR则将每一重的扩增分布在各自相对独立的空间内进行，在一定程度上降低了引物二聚体的生成，保证了扩增效率，但是微流控的实现相对较为困难，且当模板浓度较低时，易产生假阴性结果。相比于上述方法，基于固相载体表面扩增的MPCR则将不同的引物对分配至不同的固相载体上，使得每个靶标的扩增集中于以特定固相颗粒为载体的表面，从根本上解决MPCR引物间相互干扰的问题，此外将固相载体表面扩增与Luminex液相芯片检测技术相结合能够同时对各固相颗粒及颗粒表面的扩增信号进行特异性识别，并且理论上能够实现100重的核酸扩增与检测，极大地提高了检测重数的同时又能保证各靶标的扩增互不干扰，但是由于需要将引物束缚至固相载体，这在一定程度上限制了引物与模板的碰撞概率并且导致其扩增效率降低，那么如何提高固相载体表面的扩增效率值得深入思考。针对上述问题，可通过将反应体系分隔成微小液滴，或结合管式对流PCR技术使反应体系在扩增的过程中循环流动，将有望提高引物与模板之间碰撞的概率，同时提高固相载体表面的扩增效率，从而开发出扩增效率高、一致性好、体系稳定、检测重数高的多重PCR技术。