《表1 RSD PCR检测引物》

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《Lxx侵染甘蔗后在蔗茎中的积累及对蔗茎组织结构的影响》

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参照Carvalho等[6]的方法进行Lxx细胞数的定量。荧光定量标准曲线样品的制备：对Lxx菌基因组进行稀释，先用超微量分光光度计测定Lxx基因组的质量和浓度，稀释到约10 ng/μL（每次稀释后，初始浓度略有差异），作为Lxx基因组梯度稀释母液，按10倍浓度梯度稀释5个梯度。待测DNA样品用超微量分光光度计测定其浓度并做记录，每个样品取2μL用于定量分析。荧光定量的引物见表1，PCR体系为：10μL SYBR Premix ExTaq II（Tli RNaseH Plus）（2×），0.8μL正向引物Lxx12950 F1，0.8μL反向引物Lxx 12950 R1，0.4μL ROX Reference Dye II(50×），2μL DNA模板，ddH2O 6μL。PCR扩增条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，40个循环。将样品在ABI 7500上扩增，每个样品技术重复3次，以无菌水为模板的体系作对照，根据标准曲线算出每个样品的Quantity Mean，DM=Quantity Mean/Concentration of Leaf Genome(ng/μL），2.63×10-6 ng为每个Lxx细胞中基因组质量（来自Lxx CTCB07，GenBank:AE016822.1），根据公式NC=DM/2.63×10-6来评估Lxx细胞个数，NC，即为甘蔗叶片中Lxx滴度。获得的病原菌含量数据采用SPSS统计软件进行方差分析。1.2.3树脂半薄切片的制作对PCR检测成阳性的样品取样，取蔗茎芽部、近带蔗皮处、茎中央、茎节、茎间中央各部位组织，具体如图2所示。