《表1 PCR检测所用引物》

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《邻伞花烃-5-醇抗金黄色葡萄球菌机理的初步研究》

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（1） 金黄色葡萄球菌标本制备:制备方法与上述操作步骤相同（略）。（2）RNA的抽提:取适量细菌标本加到新的1.5 ml离心管中，按Hi Pure Bacterial RNA Kit细菌RNA提取试剂盒提取总RNA。提取得到的RNA采用分光光度法检测，获得OD260、OD280，并计算OD260/OD280的比值，以评价RNG提取的质量。（3）去基因组DNA:纯度较高的RNA OD260/OD280的比值接近2.0，而所提取的RNA纯度不够高，故需去除其中的基因组DNA，提高纯度。为了保证反应液配制的准确性，先按反应数×2的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中。加入RNA样品，涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底，42℃孵育2 min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。（4）cDNA的合成逆转录反应:在冰上配制反应体系，取10μl预混液加入到已完成去基因组步骤的反应管中。混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反应结束后，短暂离心，于-20℃保存。（5）实时荧光定量PCR:使用的引物见表1，按表2配制实时荧光定量PCR反应体系。95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、34 s（采集荧光信号）[5]；反应共进行40个循环，循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。（6）结果描述:R-PCR在PCR的反应体系中引入荧光基团实时监测每一次循环的荧光信号，通过荧光信号对PCR产物进行检测[9]。根据含有已知数量的靶基因（或目标微生物等）的标准品和样品的循环阙值（C）可实现对标本中靶序列拷贝数的定量检测；C值指在扩增过程中，PCR扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所需的扩增循环次数。本实验通过比较经IPMP处理的实验组与未经处理的对照组的C值，来研究IPMP对金黄色葡萄球菌核酸序列的影响，初步探究IPMP对金黄色葡萄球菌的杀灭机制。