《表1 Real-time PCR所用的引物序列》

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《5种核碱丙氨酸的合成及其抑制大鼠肝癌细胞RH35增殖的作用机制》

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分别将5 ml BRL-3A细胞和RH35细胞接种至T25细胞培养瓶中，每瓶5×105个细胞/瓶，培养24h后更换含4 mmol/L的5种核碱丙氨酸完全培养基，对照组不含核碱丙氨酸。培养48 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，按TRIzol（Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，USA）说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定260 nm和280nm的吸光度（absorbance，A），根据A260/280的比值测定RNA纯度。用变性琼脂糖凝胶电泳（70Ⅴ，20min）检测RNA的完整性。合格样品（28S/18S=2∶1）进行反转录。反转录时，按反转录试剂盒（Promega公司）说明书进行，模板为2μg总RNA。基因扩增按Reat-time PCR操作流程进行，即取1μl cDNA模板，加入1μl引物（表1），0.5μl dNTP，2.5μl PCR buffer，1μl SYBR Green，补dd H2O至总体积为20μl后，对待测基因CCNA2，PCNA，CASP3，CASP9，Bax和Bcl-2进行扩增，扩增条件:94℃2min，94℃30 s，56℃30 s，60℃30 s，共35个循环，实时采集每一反应管中荧光强度的变化，得到待测样品荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold，Ct），用2-△△Ct法对数据进行统计分析，计算出待测基因在5种不同核碱丙氨酸处理后的相对含量[15]。