《表1 Real-time PCR的引物序列》

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《钙蛋白酶2及自噬相关蛋白5对内质网应激诱导的肝细胞凋亡的影响》

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将每组细胞用PBS洗涤2次，再加入1.0mL的TRIzol裂解液置于冰上裂解10 min，收集细胞裂解液提取RNA，用核酸蛋白仪测定RNA浓度，并根据A260/A280的比值确定所提取的RNA的纯度，且所有样本的A260/A280的比值均在1.8～2.0范围内则符合实验要求。按照Thermo K1622逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系：5×reaction buffer 4μL，dNTP Mix 2μL，Oligo dT 1μL，RNase inhibitor 1μL，transcriptase 1μL，RNA样品为含1μg RNA的体积，RNase-free H2O补足反应体系。反应条件为：25℃10 min，48℃60 min，95℃5 min。逆转录后合成的cDNA保存在-4℃短期内使用。然后按照说明书配制实时荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，cDNA模板2μL，RNase-free H2O 8.5μL，总体积25μL。反应条件为：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。mRNA相对表达量用2-??Ct表示。实验所用的引物序列见表1。