《表5 不同的处理方法对SLiCE的影响》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《基于退火缓冲液的SLiCE无缝克隆方法的改良》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

在引入变性和复性的步骤之前，我们首先对线性化载体的最佳浓度进行了探索。传统的酶连接多采用20-100 ng线性化载体进行反应。Zhang等[7]认为SLiCE反应中加入10-200 ng的线性化载体和1-10倍线性化载体摩尔浓度的插入DNA的量较为合适。我们的研究发现当参与SLiCE反应的线性化载体的量从10 ng升高到50 ng时，克隆效率提高了近4倍（表5），但是随着浓度进一步提高，克隆子的数量并没有明显的提高，这可能受限于细胞裂解液中的相关外切酶的酶活。在尽可能减少线性化载体用量且保障克隆效率的原则下，本研究选用50 ng线性化载体进行实验发现，先进行SLiCE反应，再进行退火程序的方式有利于增强SLiCE克隆效率。推测可能原因，先进行SLiCE反应，可通过外切酶作用将插入DNA片段或者载体两端形成单链悬突，此时再进行退火程序，在退火缓冲液和缓慢降温过程的共同作用下，单链DNA(ssDNA）中可能形成的二级结构全部打开，可更准确地使插入DNA片段和载体同源区域的碱基产生氢键互补配对，重组形成新的质粒，进而提高重组效率。而先退火处理，再进行SLiCE反应这种方式，退火程序使线性片段和插入DNA片段的双链都打开，所生成的ss DNA在同源区域也不会形成二级结构，但此时除了线性化载体和插入DNA同源区域产生碱基互补配对外，还有线性化载体的两条ss DNA之间、插入DNA的两条ss DNA之间的竞争性碱基互补配对，这可能导致了重组效率的降低。