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第一章绪论1

第一节 前言1

第二节 蛋白质的分离方法4

一、蛋白质与小分子性质比较及分离条件差别4

二、蛋白质常用纯化方法5

三、纯化方法设计6

第三节 蛋白质纯化常用仪器和设备9

一、基本装置9

二、试剂10

第四节 蛋白质纯化时应注意的事项12

参考文献13

一、原材料来源15

第一节 原材料选择15

第二章粗制品制备15

二、原材料保存18

第二节 原材料破碎20

一、细胞破碎方法20

二、样品萃取22

第三节 样品回收24

第四节 蛋白质溶液处理方法27

一、浓缩27

二、除盐与改变缓冲溶液30

三、沉淀分离33

第五节 蛋白质沉淀方法38

一、盐析法39

二、有机溶剂沉淀49

三、其它沉淀法54

参考文献55

第三章经典液相柱色谱法57

第一节 色谱原理及基本装置57

第二节 凝胶色谱法63

一、原理63

二、凝胶种类65

三、凝胶色谱使用方法72

四、应用77

第三节 离子交换色谱法78

一、基本原理78

二、离子交换类型79

三、离子交换使用方法82

第四节 亲合色谱法85

一、固相载体选择87

二、配件选择87

三、配件与载体之间偶联方法89

四、使用方法93

第四章高效液相色谱法简介96

第一节 高效液相色谱仪98

一、贮液装置99

二、输液泵99

三、梯度洗脱装置101

四、色谱柱104

五、进样器106

六、检测器106

八、数据获取和处理系统107

七、馏分收集器107

第二节 基本概念108

一、保留值108

二、柱效能的标指111

三、分离效能总指标115

第三节 HPLC固定相123

第四节 HPLC流动相127

一、对流动相的一般要求127

二、流动相的主要性质128

参考文献129

第五章高效反相液相色谱131

第一节 作用机理132

一、疏溶剂化理论132

二、双保留机理137

三、计量置换模型141

第二节 固定相143

一、硅胶键合相填料145

二、硅胶或其它无机物涂层填料156

三、有机高分子基质填料157

四、非多孔填料159

第三节 流动相159

一、流动相组成及选择条件160

二、影响分离条件的因素161

第四节 应用169

一、HPRPC在其它分离方法无效时却非常有效169

二、基因重组入IL—2的纯化170

三、基因重组入α—IFN及人血白细胞α—IFN纯化171

四、蛋白质的氨基酸组成测定172

五、酶活性测定173

六、胰岛素的纯化174

参考文献174

第六章高效离子交换液相色谱178

第一节 保留机理178

一、静电作用模型178

二、计量置换模型180

三、实际情况中的静电作用机理182

第二节 固定相192

一、硅胶基质的离子交换剂193

二、树脂型填料199

三、非多孔填料201

一、取代离子对分离的影响204

第三节 流动相204

二、pH值206

三、梯度洗脱方式208

四、柱长209

五、温度210

六、添加剂211

第四节 应用211

四、填料对蛋白质分离影响212

一、肿瘤坏死因子212

二、膜蛋白213

三、血红蛋白213

四、单克隆抗体214

五、TGF—α—β—半乳糖苷酶215

六、HPIEC同HPRPC一样，当别的方法无效时，HPIEC往往很有效216

参考文献217

第七章高效疏水作用液相色谱220

第一节 保留机理221

一、疏液剂化理论222

二、熵增原理223

三、多价吸附作用机理223

四、优先水化作用机理224

五、其它225

六、计量置换模型226

第二节 填料230

一、基质230

二、配体231

三、填料231

一、离子强度239

第三节 影响分离因素239

二、盐240

三、添加剂241

四、固定相的疏水性242

五、pH值242

六、温度242

七、填料孔径243

第四节 蛋白质在HPHIC与HPIEC和HPRPC保留行为比较243

一、蛋白质在HPHIC和HPIEC保留行为的比较243

二、蛋白质在HPHIC和HPRPC上保留行为比较246

第五节 应用251

一、α—IFN252

二、γ—IFN252

五、其它蛋白质分离254

三、单克隆抗体254

四、IL—2254

结束语与展望255

参考文献256

第八章高效亲合液相色谱261

第一节 作用机理263

一、溶质保留机理263

二、竞争洗脱保留模型266

第二节 固定相合成268

一、载体269

二、配体270

三、空间臂274

四、填料的制备275

一、特异性洗脱方法的选择283

第三节 洗脱过程283

二、非选择性洗脱285

三、配体与蛋白质作用与它们结合常数间关系288

第四节 应用288

一、纯化蛋白质289

二、临床方面的应用289

三、通用性配体的应用289

四、特异性亲合配体的应用291

参考文献291

第九章高效排阻液相色谱302

第一节 分离原理304

一、理论保留模型304

二、模型偏差原因306

第二节 固定相合成及对分离影响309

一、硅胶基质填料309

二、聚合物填料314

三、柱填料对分离的影响317

第三节 流动相319

一、流动相的组成319

二、影响蛋白质分离的因素321

三、应用322

参考文献325

第十章高效制备液相色谱328

第一节 分离条件选择依据329

一、负载量330

二、分离效果的评价331

第二节 最佳化分离条件的建立332

一、装柱技术332

二、产品中的污染物335

三、进样336

四、检测器337

五、最佳化分离条件337

六、样品的负载与回收率纯度间的关系340

七、制备HPLC的应用341

参考文献343

第十一章其它纯化技术及其与纯化相关的方法345

第一节 蛋白质结晶345

一、制备结晶的方法346

二、影响结晶的因素347

第二节 双水相体系的蛋白质分离348

一、基本原理349

二、影响双水相分配平衡的因素350

三、实际应用352

第三节 融合蛋白亲合分离技术355

一、纯化标签选择356

二、纯化标签与配体结合特异性356

三、全属螯合纯化标签358

第四节 径向色谱358

第五节 电泳技术361

一、基本原理362

二、连续及不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳363

三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳365

四、等电聚焦电泳367

六、免疫电泳369

五、双向电泳369

七、电泳分离后样品的回收370

第六节 蛋白质定量和纯度鉴定方法371

一、定量测定方法372

二、纯度标准384

第七节 选择蛋白质纯化路线的基本途径387

一、确定要解决的问题390

二、方法的选择391

三、样品的制备393

四、专家系统393

五、最佳分离条件的建立394

六、分离路线的多样性396

参考文献396