《表1 荧光定量PCR引物》

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《氮素形态对喜树叶片生长、叶绿素荧光参数及叶绿体相关基因表达的影响》

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叶长:分别于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用直尺测量苗木的叶长（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端，精确到0.1 cm。叶面积:于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用方格纸测定苗木的叶面积（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端的整个范围，精确到0.01 cm2。叶绿素a和叶绿素b:采集喜树顶端第5，6片叶，参照李合生[12]乙醇浸提法测定叶绿素质量分数。叶绿素荧光参数:采用Li-6400便携式光合仪（LI-COR，Lincoln，美国），于晴天上午9:00-11:00测定植株上位叶（第2轮叶倒数3，4片）叶绿素荧光参数。叶片暗适应30 min后测定初始荧光产量（Fo），随后施加1次强闪光（6 000μmol·m-2·s-1，脉冲时间0.7 s）测最大荧光产量（Fm），然后在自然光下适应20 min，待荧光基本稳定再测得稳态荧光产量（Fs），最后给予1次强闪光，获得光适应下的最大荧光产量（Fm′）和最小荧光（Fo′）。各处理均3次重复。暗反应下PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，光系统下PSⅡ最大捕获效率Fv′/Fm′=（Fm′-Fo′）/Fm′，光化学猝灭系数qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），非光化学猝灭系数qNP=1-Fv′/Fm′[13]。测定叶绿素荧光参数时，同时任选3株，从各株顶端6～9片叶中任意采集3片，放入液氮罐中带回实验室置于-80℃冰箱中保存，用于测定光合酶基因的表达。叶绿体基因的表达:采用RNAperp Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）试剂提取喜树RNA；参照Reverse Transcriptase M-ML V（Takara，大连）试剂说明书合成cDNA，于-20℃储存备用。从美国国立生物技术信息中心（NCBI）上获得喜树叶绿体基因序列，以Actin为内参基因，用Primer Express software（Applied Bio systems）设计引物（表1）。反转录产物cDNA稀释10倍后，用SYBRRPrimix Ex Taq TM试剂盒（Takara，大连）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）荧光定量仪器进行目的基因qRT-PCR表达分析，反应体系为20.0μL，其中SYBRRPrimix Ex Taq TM荧光染料10.0μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物（10μmol·L-1）各0.8μL，双蒸水6.4μL。两步法PCR扩增标准程序:预变性95℃30 s；聚合酶链式反应95℃5 s，61℃30 s，40个循环，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt算法分析结果。