《表1 扩增使用的引物序列》

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《抗病毒治疗病毒学失败的HIV感染/AIDS患者基因型耐药发生情况及其影响因素》

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患者发生病毒学失败时立即进行耐药检测。采集患者肘静脉血5 m L，3 000 r/min离心15 min后取上层血浆。采用Nucli SENS@mini Mag@核酸提取系统（生物梅里埃中国有限公司）从血浆中提取HIV RNA，反转录为DNA后采用巢式PCR的方法扩增HIV-1 pol区基因片段，扩增范围为HIV-1 pol区蛋白酶基因全序列和反转录酶1～219位密码子序列，扩增使用的引物序列见表1。第一轮PCR反应总体系为25μL，运行程序:50℃30 min，95℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min 30 s，30个循环；72℃10 min。第二轮PCR反应总体系为50μL，运行程序:94℃5 min；94℃30 s，63℃30 s，72℃2 min 30 s，30个循环；72℃10 min。制备浓度为0.8%～1.0%琼脂糖凝胶，然后吸取5μL PCR产物加入上样孔，以5 V/cm电压电泳20～30 min后，将凝胶置于凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司，型号:TS-3000）内观察结果。将扩增阳性产物送北京博迈德科技发展有限公司进行测序，之后采用ChromasPro 1.3软件对序列进行编辑、拼接和校正。将合格的序列提交到斯坦福大学艾滋病病毒耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu）进行耐药性分析。该数据库将耐药程度分为敏感、潜在耐药、低度耐药、中度耐药、高度耐药5个水平，本研究将低度及以上耐药性定义为基因型耐药[6]。