《表1 Met泛素化位点的点突变扩增引物序列》

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《黑腹果蝇保幼激素受体Met泛素化修饰位点预测及功能验证》

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注:Met F和Met R引物序列中斜体加粗碱基分别为NotⅠ和XbaⅠ酶切位点；其他引物序列中的斜体加粗碱基为相应位点突变后的编码核苷酸。

根据Met的CDS序列及预测位点的信息，应用Primer Premier 5.0软件设计8对引物，引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将预测的各赖氨酸位点的编码核苷酸（AAG）序列突变为丙氨酸（GCA）序列，利用重叠PCR法对预测的各位点分别进行点突变，每个点突变克隆包括3次PCR。前2次PCR以质粒pAc5.1-Met-V5为模板，分别以Met F和相应位点的R引物，以及Met R和相应位点的F引物进行扩增。第3次PCR以前2次的PCR产物为模板，Met F和Met R为引物进行Met全长扩增。PCR扩增体系为:5×Primer star buffer 10μL，模板1μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，dNTP（10 mmol/L）1μL，Prime star 0.5μL，双蒸水补加至50μL。PCR扩增条件:95℃预变性5 min；95℃变性30 s，从70℃开始，以0.5℃为阶梯逐渐降温，以65℃为退火温度，退火时间为30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据片段大小用DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。