《表1 mglB的敲除引物与鉴定引物》

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《大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响》

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根据mglB序列设计敲除引物P1和P2，如表1所示，该对引物5'端45 bp片段与mglB基因序列同源，另外18-20 bp（表中下划线序列）与质粒pKD4上FRT-kan-FRT阅读框序列同源，以pKD4为模板进行PCR扩增可得到带有卡那霉素抗性基因的PCR片段。扩增条件为:95℃3 min；95℃30 s，55℃30s，72℃2 min，30个循环；72℃5 min。用CaCl2法将p KD46转化入SZ470和SZ470P的细胞中，通过氨苄平板筛选得到阳性菌落。将阳性菌落的细胞在添加2%的L-阿拉伯糖的LB培养基中，30℃条件下进行液体培养至OD600=0.6。经过无菌去离子水清洗后，得到SZ470/pKD46，SZ470P/pKD46的感受态细胞。再用电转的方法将扩增的PCR片段分别转化到这两种感受态细胞中。30℃复苏培养2 h，涂布于含卡那霉素的LB培养基选择平板。37℃培养24 h，挑选生长良好的阳性单克隆在卡那霉素抗性平板上转接1-2次，并用鉴定引物P3、P4进行PCR验证。将成功敲除mglB基因的SZ470和SZ470P菌株分别命名为SZ470M和SZ470PM。