《表1 荧光定量PCR引物信息》

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《不同光照时长对鸡睾丸褪黑素受体及合成酶表达的影响》

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总RNA用TR-Izol试剂盒提取，Prime Script TM RT reagent（TaKaRa）试剂盒进行反转录。（1）去除基因组DNA:5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL、1ng Total RNA，去离子水补至10μL；条件:42℃2min。（2）反转录:步骤1的反应液10μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×Prime Script Buffer 4.0μL、RNase Free dH2O 4.0μL；条件:37℃15min，85℃5s。利用Oligo7软件设计鸡MEL-1A、MEL-1B、MEL-1C、AANAT和ASMT基因荧光定量PCR引物（表1），β-actin基因引物购自上海生工生物工程股份有限公司。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行荧光定量PCR，20μL qPCR反应体系按试剂盒说明书配制:模板2μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，上、下游引物各0.8μL，去离子水6μL。采用两步法反应过程，即95℃30s；95℃5s、60℃退火34s，扩增40个循环。每组做3个重复，用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。