《表1 引物序列：参麦微球及其在Wnt信号通路下对骨髓间质干细胞分化为神经元细胞的诱导作用》

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《参麦微球及其在Wnt信号通路下对骨髓间质干细胞分化为神经元细胞的诱导作用》

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将第3代BMSC细胞以2×105个/m L接种于6孔板中，设Wnt3a、Wnt5a组及对照组。Wnt3a组和Wnt5a组分别采用诱导液1（DMEM、100μg/m L b FGF、50μg/L Wnt3a、参麦液微球）和诱导液2（DMEM、100μg/m L bFGF、50μg/L Wnt5a、参麦液微球）进行诱导，对照组不加Wnt分子而单纯采用诱导剂（DMEM、100μg/m L bFGF、参麦液微球）培养基培养。培养2周后收集细胞，采用PCR检测巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表达情况。PCR步骤:（1）总RNA的提取:使用TRIzol试剂盒提取已成功诱导的BMSC的总RNA，在微量分光光度计测定RNA的浓度及质量。（2）c DNA的合成:取2μg总RNA，使用反转录试剂盒，采用两步法获取cDNA备用，严格按照试剂盒说明书进行操作。（3）PCR反应:参考PCR试剂盒说明书方法进行操作，以同一c DNA为模板，在20μL反应体系内扩增，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，引物序列见表1。反应体系:cDNA（稀释3倍）5.0μL；上游引物0.5μL、下游引物0.5μL；SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2×） 10μL；d H2O 4.0μL。反应条件:95℃预变性30 s，95℃3 s，60℃34 s，循环45次，实验重复4次。最后使用Vii A7软件分析数据，以2-△△Ct计算目的基因mRNA的相对表达量。