《表1 FAM19A4及ACTB基因的引物及探针序列》

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《FAM19A4基因启动子甲基化在高危型HPV阴性宫颈癌诊断中的作用》

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美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统（Life Tech）用于进行实时荧光定量PCR技术检测样本中FAM19A4基因的甲基化情况。以hr-HPV阳性宫颈癌FFPE-DNA、hr-HPV阴性宫颈癌FFPE-DNA、双蒸水分别作为阳性对照、阴性对照和空白对照模板。反应体系共20μL，主要包括:2×Premix Type试剂10μL；50×Rox Reference Dye II试剂0.2μL；FAM19A4基因上、下游引物各0.5μL；ACTB内参基因上、下游引物各0.5μL；FAM19A4基因及ACTB内参基因探针各0.8μL；纯水5.2μL；样本量1μL（FAM19A4基因及ACTB内参基因的引物及探针序列如表1所示）。PC反应条件:95°C预变性3 min；然后95℃变性15 s，56℃退火20 s及65℃延伸40 s，共进行50个循环。每个样本均进行了3次重复试验。扩增结果判定:荧光定量PCR技术扩增后，经ABI 7500收集荧光信号，获得内参基因和目标基因的循环阈值（CT值）及扩增曲线，计算两基因CT值间的阈值差（ΔCT），综合判定不同样本的甲基化程度。以ACTB为内参，计算ΔCT=CT目标基因-CT内参，并同时结合扩增曲线判断甲基化情况，且ΔCT值越小，扩增曲线目标基因越早扩增，表示基因甲基化水平越高。