《表2 功能基因qPCR扩增体系》

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《DNA-SIP鉴定甘蔗//大豆间作土壤~(15)N-DNA富集位置的氮循环功能基因qPCR方法》

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以等密度梯度超高速离心分层、纯化后的DNA为模板，使用SYBRRPremix Ex TaqTMII（TaKaRa Biotechnology，Otsu，Shiga，Japan）Real Time PCR的专用试剂盒在Applied Biosystems 7500/7500 Fast RealTime PCR System（Thermo Fisher Scientific Inc.UK）上进行绝对定量PCR分析，检测各功能基因在不同浮力密度层级的拷贝数。为了准确比对各处理不同浮力密度层级DNA中功能基因拷贝数，进行qPCR操作时，对15N标记大豆单作、15N标记大豆//甘蔗间作以及不含15N标记的大豆单作对照组中各浮力密度层级DNA在96孔PCR板上同步进行点样，每个样品3次重复。标准曲线使对应功能基因的克隆重组质粒进行10倍稀释，8个稀释梯度，每个梯度3个重复，选用无菌去离子水作为阴性对照，按照表1设置扩增程序，扩增体系如表2。待PCR结束后根据标准曲线的浓度计算出样品中的基因拷贝数。最终呈现数据使用基因相对丰度表示，即相同处理中各层级DNA基因拷贝数与所有层级中最大基因拷贝数的比值[31]。