《表1 不同间皮素启动子片段PCR扩增反应体系》

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《人间皮素基因中Wnt/β-catenin通路调控元件分析及在卵巢癌细胞中启动子区鉴定》

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以间皮素1 764质粒为模板，分别扩增1 764 bp（-1456～+308）、472 bp（-164～+308）、261 bp（+47～+308）片段。引物间皮素1764 F:5'-TTTCTCT ATCGATAGGTACCAGCGCGTTTTCATCATTGTCC-3'，R:5'-CTTAGATCGCAGATCTGCTGGCAGCGCCCATG AG-3'；间皮素472 F:5'-TTTCTCTATCGATAGGT ACC GCTTTGCCTTCCTGGGCAT-3'；间皮素261 F:5'-TTTCTCTATCGATAGGTACCGAGGCTCAGGTGTG GCCAA-3'。反应体系见表1。反应条件:94℃3 min 1个循环；98℃10 s、55℃15 s、72℃2 min，合计30个循环；2℃10 min，1个循环。产物行琼脂糖凝胶电泳。按前述方法行产物纯化。质粒DNA制备酶切反应体系:pGL3-Basic 10μL、10×T Buffer5μL、Kpn I（10 U/μL）2.5μL、BglⅡ（10 U/μL）2.5μL、d H2O Up to 50μL。反应条件:37℃4 h。切胶回收目的片段，进行琼脂糖凝胶电泳。用In-FusionHD Cloning Kit（Clontech Code No.639633），分别将间皮素1764 Insert DNA、间皮素472 Insert DNA、间皮素261 Insert DNA和Vector DNA连接，连接体系:Vector DNA（50 ng/μL）1μL、Insert DNA（80 ng/μL）1μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL、dH2O Up to 10μL。反应条件:50℃15 min。筛选阳性克隆，并进行测序。